苯扎氯銨在不同介質中殺滅鼠傷寒沙門氏菌的效果分析

陳丹妍，蔡雅雯，黃煒雅，王玉嬋，王 妍

(細胞逆境響應與代謝調控福建省高校重點實驗室/福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350108)

鼠傷寒沙門氏菌作為一種人畜共患病最為常見的病原菌之一，由于其耐藥性極速形成，多重耐藥沙門氏菌分離株出現并迅速傳播，嚴重影響了畜牧業和農業的發展，對公共衛生造成了日益嚴重的影響[1]。因此消毒劑被廣泛地用于沙門氏菌疾病的防治，是食品生產清洗、消毒過程中使用的主要化合物[2-3]。研究發現，消毒劑通常攻擊多個部位，整體損傷才會產生殺菌效果[4]。自1935年德國人Domagk[5]發現烷基二甲基氯化銨的殺菌作用以來，季銨鹽類抗菌劑的劑型和消毒效果研究一直是消毒領域關注的重點。與傳統次氯酸鈉、雙氧水等常用氧化型消毒劑相比，季銨鹽消毒劑具有毒性低、高水溶性、刺激性小和存儲使用方便的優點，所以被廣泛應用在日常生產生活中[6]。

苯扎氯銨(Benzalkonium chlorides，BACS)消毒劑作為常用的季銨鹽消毒劑之一，同時也是一種陽離子表面活性劑，通過破壞脂質膜雙層發揮作用，可有效對抗幾種光生微生物，尤其是革蘭氏陽性菌[7]。眼部感染的細菌大多都為革蘭氏陽性菌，例如肺炎鏈球菌、表皮葡萄球菌及金黃色葡萄球菌等[8]，所以一般會在滴眼液中添加抑菌劑苯扎氯銨。常見的氯化鈉滴眼液主要成分為氯化鈉，其中加入了苯扎氯銨，還含有玻璃酸鈉等成分，主要用于緩解眼睛疲勞引起的局部干澀[9]。使用氯化鈉作為滴眼液的主要成分，主要是因為其與人體生理環境最為接近，但是否能使苯扎氯銨抑菌效果達到最好，還未有明確的證據，可能存在其他介質能使苯扎氯銨發揮更好的作用也未可知。

在很長一段時間里，基于細菌不能同時形成多種耐藥性機制的假設，對消毒劑或消毒劑的耐藥性并沒有引起人們的重視[10]。然而，在三氯生這一常用陽離子消毒劑的具體耐藥機理被報道后[11-12]，對季銨鹽等其他陽離子劑的耐藥機理的重新評價引起了研究者們的極大關注[13]。盡管苯扎氯銨的殺菌機制是非特異性的[14]，但已經出現了耐性突變體，這表明細菌的適應性，尤其是沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌[15]。例如，苯扎氯銨廣泛用于農牧業的消毒以及食品行業的表面、器具和儀器消毒，這導致鼠傷寒沙門氏菌已經對苯扎氯銨逐漸產生耐藥性[1]。

為了減緩鼠傷寒沙門氏菌對苯扎氯銨的耐藥性，因此本試驗開始探究苯扎氯銨殺滅鼠傷寒沙門氏菌效果最好的條件，首先在ddH2O和0.9% NaCl介質中做了嘗試，發現在0.9% NaCl介質中會抑制苯扎氯銨的殺菌效果。隨后在6種不同介質中進行驗證，再通過添加8種不同的氨基酸進行試驗，最終發現是介質中解離的陰離子會抑制其殺菌效果。為了排除菌種特異性，在典型的耐藥菌肺炎克雷伯氏菌及金黃色葡萄球菌中也驗證了這一現象。通過本研究結果，期望能最大限度地發揮苯扎氯銨的作用，并減緩細菌對其產生的耐藥性，減輕農牧業發展的負擔。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株：鼠傷寒沙門氏菌SL1344、肺炎克雷伯氏菌KP-D367、金黃色葡萄球菌ATCC25923，由細胞逆境響應與代謝調控福建省高校重點實驗室保藏。

1.2 試驗藥品與儀器

試劑藥品：苯扎氯銨(BACS)、氯化鈉(NaCl)、二甲基亞砜(DMSO)、葡萄糖(Glucose)、正丁醇(1-Butanol)、氯化鉀(KCl)、氯化鈣(CaCl2)、氯化鎂(MgCl2)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)。以上藥品配制成溶液后均經過0.22 μm微孔濾膜過濾確保無菌后備用。

試劑藥品及使用濃度：BACS儲液(25 mg·mL-1)、NaCl(0.9%)、DMSO(1%)、Glucose(10 mmol·L-1)、1-Butanol(0.3 mol·L-1)、KCl(100 mmol·L-1)、CaCl2(100 mmol·L-1)、MgCl2(100 mmol·L-1)、8種氨基酸Leu/Met/Cys/Gly/Asp/Glu/Lys/Arg(10 mg·mL-1) 。

1.3 試驗方法

1.3.1菌種活化及稀釋點板方法 (1)活化菌種。取-80℃凍存的細菌菌液2 μL，加入到1 mL LB液體培養基中，于搖床(37℃、220 r·min-1)過夜培養進行菌種活化，所得菌液以1∶500的比例接種于LB液體培養基中，于搖床(37℃、220 r·min-1)培養24 h，即得平臺期細菌菌液。(2)稀釋點板。處理并洗滌后的所得菌液按每次10倍的梯度用PBS緩沖液稀釋，稀釋梯度為101、102、103、104、105，每個稀釋度取4 μL菌液點在LB固體培養基平板上，倒置于37℃恒溫培養箱12 h后，檢查細菌死亡并進行計數，計算細菌經處理后的存活率。

1.3.2苯扎氯銨在ddH2O和0.9% NaCl介質中殺滅平臺期鼠傷寒沙門氏菌效果的差異 取平臺期鼠傷寒沙門氏菌50 μL的菌液離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，單處理組分別用100 μL ddH2O和0.9% NaCl溶液重懸菌體，雙處理組分別用100 μL含苯扎氯銨的ddH2O和0.9% NaCl溶液重懸菌體，苯扎氯銨終濃度分別設定為40、50、60、70、80 μg·mL-1，處理時間設定為3 min。處理時間結束后立即離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS緩沖液重懸菌體，洗滌2次后，再加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體。

1.3.3在6種不同介質中驗證苯扎氯銨殺滅平臺鼠傷寒沙門氏菌效果的差異 發現在ddH2O和0.9% NaCl介質中苯扎氯銨的殺菌效果存在很大的差異后，首先分析了ddH2O與0.9% NaCl的化學性質，再結合苯扎氯銨的成分及殺菌機制，猜想可能是由于NaCl會在溶液中解離成Na+和Cl-，溶液中存在的離子會抑制苯扎氯銨的殺菌效果。因此隨機挑選了2大類共6種介質，第1類是DMSO、葡萄糖及正丁醇，在溶液中不會解離；第2類是KCl、CaCl2及MgCl2，在溶液中會發生解離。

取平臺期鼠傷寒沙門氏菌50 μL的菌液離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，單處理組分別用100 μL含1% DMSO、10 mmol·L-1Glucose、0.3 mol·L-11-Butanol、100 mmol·L-1KCl、100 mmol·L-1CaCl2、100 mmol·L-1MgCl2的水溶液重懸菌體，雙處理組分別用100 μL含苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+1% DMSO、苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+10 mmol·L-1Glucose、苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+0.3 mol·L-1正丁醇、苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+100 mmol·L-1KCl、苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+100 mmol·L-1CaCl2、苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+100 mmol·L-1MgCl2的水溶液重懸菌體，處理時間設定為3 min。處理時間結束后立即離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS緩沖液重懸菌體，洗滌2次后，再加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體。

1.3.4添加8種不同氨基酸驗證苯扎氯銨殺菌受到陰離子(負電)的抑制 發現苯扎氯銨在溶液中會解離的介質里殺菌效果會受到很大的抑制，但僅驗證了是解離的離子影響了苯扎氯銨的殺菌效果，是溶液中的陽離子還是陰離子影響更大有待研究。因此隨機挑選了4大類共8種氨基酸，第1類是非極性氨基酸中的亮氨酸和甲硫氨酸，第2類是極性不帶電氨基酸中的半胱氨酸和甘氨酸，第3類是極性帶正電氨基酸中的精氨酸和賴氨酸，第4類是極性帶負電氨基酸中的天冬氨酸和谷氨酸。通過在水溶液中分別添加這8種氨基酸，作為苯扎氯銨的殺菌介質，開展了本階段的試驗來驗證是陽離子還是陰離子抑制苯扎氯銨的殺菌效果。

取平臺期鼠傷寒沙門氏菌50 μL的菌液離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，單處理組分別用100 μL含10 mg·mL-1亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸的水溶液重懸菌體，雙處理組分別用100 μL含60 μg·mL-1苯扎氯銨的亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸的水溶液重懸菌體，處理時間設定為3 min。處理時間結束后立即離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS緩沖液重懸菌體，洗滌2次后，再加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體。

1.3.5在平臺期肺炎克雷伯氏菌及金黃色葡萄球菌中驗證介質對苯扎氯銨殺菌的影響 為了排除菌種特異性，本階段也隨機挑選本試驗室現有保藏的兩種菌，一種為典型的革蘭氏陰性菌肺炎克雷伯氏菌，一種是典型的革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌。在這兩種菌中驗證是否苯扎氯銨的殺菌也存在被陰離子抑制的現象。

分別取平臺期肺炎克雷伯氏菌及金黃色葡萄球菌50 μL的菌液離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，單處理組分別用100 μL ddH2O和0.9 % NaCl溶液重懸菌體，雙處理組分別用100 μL含苯扎氯銨的ddH2O和0.9 % NaCl溶液重懸菌體，處理肺炎克雷伯氏菌時苯扎氯銨終濃度分別設定為80、90、100 μg·mL-1，處理金黃色葡萄球菌時苯扎氯銨終濃度分別設定為100、120、150 μg·mL-1，處理時間設定為3 min。處理時間結束后立即離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS緩沖液重懸菌體，洗滌2次后，再加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體。

1.4 數據處理與分析

試驗中的數據統計通過ANOVA方差分析，數據來源于3次獨立試驗。

2 結果與分析

2.1 苯扎氯銨在ddH2O和0.9% NaCl介質中殺滅平臺期鼠傷寒沙門氏菌效果的差異

由圖1可知，苯扎氯銨處理時間都為3 min時，40 μg·mL-1的濃度在ddH2O介質和0.9% NaCl介質中殺菌效果差異并不大，僅差異1個數量級。但隨著苯扎氯銨濃度的提高，處理時間不變的條件下，在兩種介質中殺菌效果差異顯著。對比ddH2O介質，在0.9% NaCl介質中苯扎氯銨的殺菌效果明顯變差，在80 μg·mL-1的濃度時，二者差異達到5個數量級。說明苯扎氯銨的殺菌受到了0.9% NaCl的抑制。因此，本試驗發現在苯扎氯銨濃度相同及處理時間一致的條件下，僅改變苯扎氯銨的介質，就導致殺菌效果存在極大差異。

圖1 苯扎氯銨在ddH2O和0.9% NaCl介質中殺滅平臺期鼠傷寒沙門氏菌效果的差異Fig.1 Differences of the efficacy of benzalkonium chloride in killing Salmonella typhimurium at platform period in the medium of ddH2O and 0.9% NaCl

2.2 在6種不同介質中驗證苯扎氯銨殺滅平臺期鼠傷寒沙門氏菌效果的差異

由圖2可知，苯扎氯銨濃度都為60 μg·mL-1時，苯扎氯銨在6種不同介質中殺菌效果都存在差異，主要可以分為2類。在DMSO、葡萄糖及正丁醇介質中，苯扎氯銨殺菌效果明顯，與DMSO、葡萄糖及正丁醇單處理組相比差異極顯著(P<0.000 1)；而在KCl、CaCl2及MgCl2介質中，苯扎氯銨殺菌效果很差，與KCl、CaCl2及MgCl2介質單處理組相比差異不顯著(P>0.05)。本試驗發現在不會解離的介質DMSO、葡萄糖及正丁醇中，苯扎氯銨的殺菌效果顯著，說明其殺菌效果不會受到抑制；而在會解離的介質KCl、CaCl2及MgCl2中，苯扎氯銨基本沒有殺菌效果，說明其殺菌效果會受到明顯的抑制。

注：****表示P<0.000 1；NS表示P>0.05圖2 在6種不同介質中驗證苯扎氯銨殺滅平臺期鼠傷寒沙門氏菌效果的差異Fig.2 Differences of the efficacy of benzalkonium chloride in killing Salmonella typhimurium at platform period tested in six different media

2.3 添加8種不同氨基酸驗證苯扎氯銨殺菌受到陰離子(負電)的抑制

由圖3可知，在水溶液中分別添加非極性氨基酸中的亮氨酸和甲硫氨酸、極性不帶電氨基酸中的半胱氨酸和甘氨酸及極性帶正電氨基酸中的精氨酸和賴氨酸，苯扎氯銨的殺菌效果明顯，與單處理組相比差異極顯著(P<0.000 1)。而在水溶液中分別添加極性帶負電氨基酸中的天冬氨酸和谷氨酸，苯扎氯銨的殺菌效果較其他類氨基酸明顯變差，與單處理組相比差異較顯著(P<0.01)。因此可以得出結論，苯扎氯銨的殺菌效果受到陰離子的抑制，也就是受到負電的影響。

注：****表示P<0.000 1；**表示P<0.01圖3 添加8種不同氨基酸驗證苯扎氯銨殺菌受到陰離子(負電)的抑制Fig.3 Addition of eight different amino acids to verify the inhibition of bactericidal effect of benzalkonium chloride by anions (negative electricity)

2.4 在平臺期肺炎克雷伯氏菌及金黃色葡萄球菌中驗證介質對苯扎氯銨殺菌的影響

由圖4A和圖4B可知，在肺炎克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌中，苯扎氯銨對比在ddH2O介質與0.9% NaCl介質中，在ddH2O介質中殺菌效果比在0.9% NaCl介質中顯著。因此可以得出結論，在肺炎克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌中苯扎氯銨的殺菌也存在被陰離子抑制的現象，而非苯扎氯銨對鼠傷寒沙門氏菌的特異性。

圖4 在平臺期肺炎克雷伯氏菌及金黃色葡萄球菌中驗證介質對苯扎氯銨殺菌的影響Fig.4 Effect of the medium on the sterilization of benzalkonium chloride tested in Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus aureus at platform period

3 結論與討論

目前，畜禽細菌耐藥研究已受到國內外研究人員的廣泛關注，已有大量關于畜群細菌耐藥的研究報道，但未見我國從致病菌的角度，對來源于病死畜禽的多種潛在致病菌的研究報道[16-17]。研究者們大都聚焦于抗生素的增效減毒及新型抗生素的研發，但新抗生素的研發及批準上市又陷入極為艱難的境地，所以尋找對沙門氏菌具有殺菌活性的其他藥物迫在眉睫，可以顯著降低新型抗生素研發的壓力。因此本研究想從鼠傷寒沙門氏菌和苯扎氯銨入手，對其耐藥性做一個深入的探究。

未來，對苯扎氯銨耐藥突變體的發病機制和流行病學研究將變得越來越重要[10]。本研究的發現有助于進一步了解更好的消毒劑使用方法，那就是在不同的環境下可以特異性選擇不同的消毒劑來進行消毒。在生產和使用苯扎氯銨時，就可通過此方法來優化苯扎氯銨，例如苯扎氯銨溶劑的選擇以及在不具有或只有少數陰離子的環境下選擇苯扎氯銨消毒劑來進行消毒。然而關于此現象，本研究僅發現并初步驗證，還需要進行后續研究，深入探究苯扎氯銨殺菌是如何受到陰離子的抑制，對其具體作用機制進行解釋。日后以期本研究結果能夠將苯扎氯銨在農牧業中應用得更加規范，使其殺菌效果良好又不易產生耐藥性，以此協助農牧業進一步發展。