佛羅里達(dá)文昌魚的繁殖頻次研究

張 翔，張秋金

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350117)

文昌魚隸屬于脊索動(dòng)物門頭索動(dòng)物亞門，因其在動(dòng)物進(jìn)化上占據(jù)重要地位，可以作為研究脊椎動(dòng)物起源與演化的模式生物[1]，而且文昌魚具有豐富的營養(yǎng)成分，尤其是4種鮮味氨基酸和不飽和脂肪酸含量較高[2]，是一種優(yōu)良的水產(chǎn)養(yǎng)殖對象。中國廈門同安劉五店曾盛產(chǎn)文昌魚，形成世界上唯一一個(gè)文昌魚漁場，當(dāng)?shù)貪O民抓捕文昌魚歷史悠久[3]，但是由于棲息環(huán)境遭受破壞，文昌魚種群數(shù)量嚴(yán)重下降[4]，已被列為國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。不論是作為模式生物的科研價(jià)值還是作為珍稀物種的保護(hù)或珍稀水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的開發(fā)，都有必要深入研究文昌魚的繁殖規(guī)律。關(guān)于文昌魚的繁殖生物學(xué)已有不少報(bào)道[5-10]，但是迄今為止文昌魚在個(gè)體水平上一年可以繁殖幾次仍然不清楚[5]，因?yàn)槲牟~是潛居在淺海沙灘，繁殖季節(jié)天黑以后，雄雌文昌魚先后從沙中闖出，排精排卵，卵子在海水中受精，難以觀察海區(qū)文昌魚的繁殖。隨著實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)繁育文昌魚技術(shù)的突破[11-12]，可以在實(shí)驗(yàn)室條件下觀察文昌魚的繁殖，本研究以實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)繁育的佛羅里達(dá)文昌魚Branchiostomafloridae作為研究對象，連續(xù)3年觀察其每年的繁殖次數(shù)，發(fā)現(xiàn)佛羅里達(dá)文昌魚繁殖力較強(qiáng)，作為人工養(yǎng)殖對象具有明顯優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)用文昌魚是實(shí)驗(yàn)室科研引進(jìn)后人工飼養(yǎng)繁育的子三代佛羅里達(dá)文昌魚。試驗(yàn)開始時(shí)，文昌魚處于二齡期(第1年繁育出來的文昌魚，到第2年定義為一齡期，第3年定義為二齡期，以此類推)，挑選性腺發(fā)育飽滿的10雌(♀)10雄10(♂)，編號(hào)依次為♀1～♀10、♂1～♂10。本試驗(yàn)連續(xù)觀測了3年直至四齡期結(jié)束，在試驗(yàn)過程中，有文昌魚發(fā)生意外或自然死亡，二齡期結(jié)束、三齡期開始繁殖前剩余8雌8雄；三齡期結(jié)束、四齡期開始繁殖前只剩下5雌7雄。為了確保不因種群變小而可能影響被研究對象的正常產(chǎn)卵/排精，四齡期開始繁殖前，另外隨機(jī)挑選6雌5雄，共同飼養(yǎng)在同一個(gè)容器內(nèi)，但新增個(gè)體的數(shù)據(jù)不列入試驗(yàn)對象的統(tǒng)計(jì)分析范圍。

1.2 試驗(yàn)方法

在體視顯微鏡下對佛羅里達(dá)文昌魚逐尾觀察，測量體長、計(jì)數(shù)身體左右側(cè)性腺數(shù)目，觀察喙鰭和臀前鰭鰭室的細(xì)微差別，對不同個(gè)體進(jìn)行辨識(shí)。然后將文昌魚一起飼養(yǎng)在透明方形塑料桶(規(guī)格32 cm×22 cm×19 cm)中，桶底墊以適合文昌魚潛居的海沙厚度5 cm左右，加入經(jīng)沙濾處理的天然海水，高出沙面5～10 cm，連續(xù)充氣，置于人工控制光照周期和溫度的室內(nèi)，設(shè)置14 h光照和10 h黑暗的光照周期(14 L∶10 D)，全年溫度20℃～30℃。每天早晨和傍晚定時(shí)定量投喂以等鞭金藻Isochrysiszhanjiangensis和角毛藻Chaetocerosmuelleri為主的混合單細(xì)胞藻類。文昌魚的日常飼養(yǎng)管理根據(jù)之前的報(bào)道進(jìn)行[11-12]。在產(chǎn)卵季節(jié)，每天用尼龍撈網(wǎng)在飼養(yǎng)容器內(nèi)撈檢，確定是否產(chǎn)卵，若發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵，則收集受精卵，記錄產(chǎn)卵日期。

不定期觀測每1尾文昌魚的性腺發(fā)育狀態(tài)，觀測臨近產(chǎn)卵期和剛產(chǎn)卵后的性腺狀態(tài)。在體視顯微鏡下觀察性腺的發(fā)育期、測量性腺直徑。性腺的發(fā)育期分為未發(fā)育期、Ⅰ期(增殖期)、Ⅱ期(小生長期)、Ⅲ期(大生長期)、Ⅳ期(生長后期)、Ⅴ期(成熟期)和產(chǎn)后等7個(gè)階段[13]。性腺的直徑是指沿文昌魚身體背腹軸方向上性腺的長度，佛羅里達(dá)文昌魚身體兩側(cè)各有20余個(gè)性腺，測量其身體左側(cè)前中段最大的性腺直徑，拍照時(shí)視野的左側(cè)從文昌魚身體左側(cè)第4個(gè)性腺開始。

在統(tǒng)計(jì)分析每年文昌魚產(chǎn)卵/排精時(shí)，凡是當(dāng)年繁殖季節(jié)中途死亡的個(gè)體不參與本年度平均值計(jì)算，另外終生不排精的♂10也不參與統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 佛羅里達(dá)文昌魚不同個(gè)體的識(shí)別

當(dāng)多尾文昌魚飼養(yǎng)在同一個(gè)容器，首先需要對不同個(gè)體進(jìn)行辨認(rèn)，佛羅里達(dá)文昌魚不同個(gè)體之間在外形上都有容易辨認(rèn)的細(xì)微差別，根據(jù)性別、體長以及在體視顯微鏡下觀察喙鰭的形狀、臀前鰭內(nèi)多個(gè)鰭室的形態(tài)及位置關(guān)系等特征可以準(zhǔn)確對佛羅里達(dá)文昌魚進(jìn)行個(gè)體辨認(rèn)。由圖1可知，佛羅里達(dá)文昌魚不同個(gè)體(♀5、♀7、♀8、♂1、♂6、♂7)的喙鰭和臀前鰭鰭室有明顯的細(xì)微差別，能很好地對不同個(gè)體進(jìn)行辨識(shí)。

注：正方形虛線框顯示喙鰭的形狀，長方形虛線框顯示臀前鰭內(nèi)多個(gè)鰭室的形態(tài)；標(biāo)尺1 mm。圖1 佛羅里達(dá)文昌魚不同個(gè)體形態(tài)上的細(xì)微差異Fig.1 Subtle differences in the morphology of different individuals of Branchiostoma floridae

2.2 佛羅里達(dá)文昌魚個(gè)體的性腺發(fā)育變化

佛羅里達(dá)文昌魚在一個(gè)繁殖周年里，4月份開始產(chǎn)卵可持續(xù)到12月份。期間性腺可以重復(fù)發(fā)育成熟，多次繁殖。雌性第5號(hào)(♀5)和雄性第7號(hào)(♂7)在三齡期的性腺直徑變化見圖2，♀5和♂7三齡期不同時(shí)間性腺外觀的變化見圖3。♀5在三齡期當(dāng)年4月16日卵巢已經(jīng)發(fā)育成熟，處于Ⅴ期，呈淡黃白色、非常飽滿，卵巢與卵巢之間緊密排列，幾乎沒有縫隙，卵巢內(nèi)卵子排列也很緊密(圖2A)。4月19日發(fā)生第1次產(chǎn)卵，產(chǎn)卵量大，4月22日的卵巢顯著縮小，卵巢中還有不少未成熟卵子，呈Ⅲ期形態(tài)，卵子之間的排列松散(圖2B)。隨后卵巢重新發(fā)育，5月19日的卵巢再次發(fā)育成熟，很飽滿、處于Ⅴ期(圖2C)。5月24日發(fā)生第2次產(chǎn)卵(與第1次產(chǎn)卵間隔35 d)，5月27日可見卵巢縮小，但殘留的未成熟卵子還比較多(圖2D)。產(chǎn)卵后卵巢繼續(xù)發(fā)育，6月18日卵巢第3次成熟(圖2E)。6月26日第3次產(chǎn)卵(間隔33 d)，產(chǎn)卵后卵巢變小，呈Ⅳ期(圖2F)。之后卵巢繼續(xù)發(fā)育，7月23日處于Ⅴ期(圖2G)，間隔較長時(shí)間后于8月17日第4次產(chǎn)卵(間隔52 d)，但產(chǎn)卵量較少，8月23日卵巢還比較飽滿(圖2H)，之后卵巢還是繼續(xù)發(fā)育，9月4日卵巢更飽滿(圖2I)。9月6日第5次產(chǎn)卵(間隔20 d)，而且產(chǎn)卵量較多，卵巢直徑變小，9月14日可見卵巢內(nèi)殘余的未成熟卵子間隙比較明顯(圖2J)；從9月到10月卵巢繼續(xù)發(fā)育，但是發(fā)育速度緩慢，直到10月25日卵巢再次發(fā)育成熟，很飽滿，為Ⅴ期(圖2K)。10月30日發(fā)生第6次產(chǎn)卵(間隔54 d)，產(chǎn)卵量較大，10月31日卵巢變小，殘留的未成熟卵子較少(圖2L)；但是隨著卵巢的再次發(fā)育，11月26日再一次成熟，為Ⅴ期(圖2M)，然后12月3日第7次產(chǎn)卵(間隔34 d)，產(chǎn)卵量適中，12月8日卵巢變小，里面還有不少卵子(圖2N)，之后當(dāng)年未見♀5再產(chǎn)卵，直到三齡期繁殖周年結(jié)束，♀5一共產(chǎn)卵7次。

圖2 三齡期♀5和♂7佛羅里達(dá)文昌魚性腺直徑的變化Fig.2 Changes of the gonadal diameter of Branchiostoma floridae with female 5 and male 7 at the third instar

注：左側(cè)2列、大寫字母A～N表示♀5號(hào)，右側(cè)2列、小寫字母a～n表示♂7，括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示月份和日期。黑色粗剪頭指示左側(cè)第7個(gè)卵巢，白色細(xì)箭頭指示左側(cè)第7個(gè)精巢；標(biāo)尺1 mm。圖3 三齡期♀5和♂7佛羅里達(dá)文昌魚性腺外觀的變化Fig.3 Changes of the gonadal appearance of Branchiostoma floridae with female 5 and male 7 at the third instar

♂7在三齡期當(dāng)年4月16日時(shí)精巢已經(jīng)發(fā)育成熟，處于Ⅴ期，呈白色均質(zhì)狀、很飽滿(圖2a)。4月19日第1次排精后，4月22日的精巢顯著變薄變小，精巢中還有不少精子，呈不均勻云霧狀(圖2b)。第1次排精后精巢隨即重新發(fā)育，5月19日的精巢再次發(fā)育成熟，處于Ⅴ期，非常飽滿(圖2c)。5月24日發(fā)生第2次排精(間隔35 d)，5月27日的精巢明顯皺縮變小(圖2d)。第2次排精后精巢繼續(xù)發(fā)育，6月18日時(shí)精巢發(fā)育成熟為Ⅴ期(圖2e)。6月26日發(fā)生第3次排精(間隔33 d)，7月1日精巢變小(圖2f)，這次排精后精巢發(fā)育比較緩慢，經(jīng)歷近1個(gè)月，到7月23日時(shí)精巢發(fā)育，但不是很飽滿，處于Ⅳ期(圖2g)。之后繼續(xù)發(fā)育，間隔較長時(shí)間后于8月17日發(fā)生第4次排精(間隔52 d)，排精量較少，8月23日精巢變小(圖2h)。重新發(fā)育后至9月4日精巢又發(fā)育成熟，但較小(圖2i)；9月6日第5次排精(間隔20 d)，排精量較少，9月14日的精巢變小，較8月23日的精巢稍大一點(diǎn)(圖2j)。經(jīng)歷較長時(shí)間的發(fā)育后，到10月25日精巢發(fā)育更加飽滿(圖2k)，10月30日發(fā)生第6次排精(間隔54 d)，10月31日精巢縮小(圖2l)，之后精巢緩慢恢復(fù)，于11月26日精巢稍有增大(圖2m)，但12月8日后，未見明顯變化(圖2n)，直到當(dāng)年繁殖季節(jié)結(jié)束，未見其再排精。可見♂7在三齡期這一年共排精6次。

2.3 佛羅里達(dá)文昌魚的繁殖次數(shù)

由表1可知，從二齡期到四齡期，期間有文昌魚發(fā)生意外或自然死亡(表1)。至四齡期繁殖季節(jié)結(jié)束后(12月15日)還有4♀5♂，但是文昌魚的狀態(tài)欠佳，過冬期間大多死亡，到五齡期1月13日只剩下1♀1♂，不久后死亡，試驗(yàn)結(jié)束。每年中途死亡的個(gè)體不參與當(dāng)年度平均繁殖頻次的統(tǒng)計(jì)，另外終生不排精的♂10也不參與統(tǒng)計(jì)。這樣參與統(tǒng)計(jì)分析的二齡期8♀9♂、三齡期5♀7♂、四齡期4♀5♂，不計(jì)年齡3年總共38尾(次)的年繁殖次數(shù)平均(6.8±1.5)次，其中雌性17尾(次)，產(chǎn)卵5～9次、平均(7.4±1.4)次；雄性21尾(次)，排精4～9次、平均(6.4±1.5)次，可見雌性產(chǎn)卵次數(shù)比雄性排精次數(shù)多。從不同齡文昌魚的繁殖頻次來看，二齡期可繁殖(7.3±1.4)次，三齡期(5.7±0.7)次，四齡期(7.4±1.7)次。

表1 佛羅里達(dá)文昌魚個(gè)體水平的繁殖次數(shù)Table 1 Reproductive frequency of Branchiostoma floridae at the individual level

3 結(jié)論與討論

3.1 影響文昌魚繁殖的環(huán)境因素

目前，文昌魚還只在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行小規(guī)模的人工繁育，實(shí)驗(yàn)室餌料供給、海水鹽度、溫度、光照周期等外界因素都可能影響文昌魚的生長和發(fā)育。在實(shí)驗(yàn)室通過提供足夠的餌料、保持文昌魚棲息沙層潔凈可以保證文昌魚正常生長以及性腺發(fā)育成熟[11]。本研究通過大量培養(yǎng)等鞭金藻、角毛藻、扁藻Platymonassubcordiformis、小球藻Chlorella等單細(xì)胞藻類，每天投喂以金藻、角毛藻為主的單細(xì)胞混合藻液，給文昌魚提供了足量的餌料，同時(shí)經(jīng)常清洗文昌魚棲息沙層，保證文昌魚的棲息環(huán)境適宜。文昌魚性腺充分發(fā)育、具備了合適的繁殖生理?xiàng)l件后，它的繁殖時(shí)間主要取決于溫度，水溫的升高會(huì)促使文昌魚性腺開始發(fā)育，到一定程度又可以促使其產(chǎn)卵[14]，實(shí)驗(yàn)室里佛羅里達(dá)文昌魚產(chǎn)卵時(shí)的水溫通常在22℃～28℃。光照周期長短對文昌魚生殖細(xì)胞的發(fā)生和性腺生長也有顯著的影響，佛羅里達(dá)文昌魚產(chǎn)卵需要長光照條件[15]，文昌魚對光敏感，黑暗條件有利于文昌魚產(chǎn)卵[15]，文昌魚產(chǎn)卵/排精發(fā)生在黑暗環(huán)境，為了工作方便，將實(shí)驗(yàn)室的文昌魚長期飼養(yǎng)在人工控光周期(14 L∶10 D)條件下，即每天上午10:30開始連續(xù)黑暗10 h，晚上20:30開始連續(xù)光照14 h，在此光照周期條件下，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的白氏文昌魚B.belcheri、日本文昌魚B.japonicum和佛羅里達(dá)文昌魚都可以正常產(chǎn)卵繁殖。

3.2 佛羅里達(dá)文昌魚的繁殖次數(shù)

人工飼養(yǎng)條件下，佛羅里達(dá)文昌魚從4月份開始產(chǎn)卵，可以持續(xù)到12月份，其繁殖季節(jié)比較長，期間每個(gè)個(gè)體可以多次繁殖，雌性個(gè)體每年產(chǎn)卵5～9次、平均7.4次，雄性排精4～9次、平均6.4次，顯示雌性的繁殖次數(shù)多于雄性；二齡期個(gè)體可以繁殖4～9次，平均7.3次；三齡期可以繁殖5～7次，平均5.7次，四齡期繁殖4～9次，平均7.4次。每次產(chǎn)卵或排精后，性腺需要經(jīng)過一段時(shí)間得以恢復(fù)和重新發(fā)育，其所需時(shí)間間隔從數(shù)日到數(shù)月不等(表1)，這與每次產(chǎn)卵或排精時(shí)性腺的排空程度有關(guān)系，如果文昌魚當(dāng)次產(chǎn)卵/排精量大、性腺排空后就需要較長時(shí)間進(jìn)行重新發(fā)育，如果當(dāng)次產(chǎn)卵/排精量少、性腺?zèng)]有排空，則間隔時(shí)間就短。性腺的發(fā)育需要有足夠的營養(yǎng)作保障，有報(bào)道認(rèn)為野生的佛羅里達(dá)文昌魚能多次產(chǎn)卵，可能與其鰭條可以儲(chǔ)藏營養(yǎng)、能提供多次繁殖所需的營養(yǎng)有關(guān)[7,10]，但是日本文昌魚B.japonicum鰭條沒有儲(chǔ)備營養(yǎng)的功能[7]，本研究看不出佛羅里達(dá)文昌魚多次產(chǎn)卵/排精是否與鰭條有關(guān)，在飼養(yǎng)條件下，通過供應(yīng)餌料充足，保障多次繁殖所需的營養(yǎng)。

隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，佛羅里達(dá)文昌魚會(huì)逐漸死亡，本研究的試驗(yàn)動(dòng)物壽命最長只達(dá)五齡期，四齡期之前有繁殖。關(guān)于佛羅里達(dá)文昌魚的壽命和繁殖年齡目前還缺乏文獻(xiàn)報(bào)道，我們實(shí)驗(yàn)室在飼養(yǎng)過程中子一代有個(gè)別可以存活到7齡期以上，期間從1齡期到6齡期都見有產(chǎn)卵，其中2齡期到4齡期可能是其繁殖的旺盛期。本研究觀察了子三代一個(gè)小種群的繁殖情況，而不同代之間的繁殖力是否有差異有待于進(jìn)一步觀察。

3.3 不同種文昌魚的繁殖頻次

全世界的文昌魚30種左右，研究報(bào)道主要是文昌魚屬Branchiostoma的白氏文昌魚、日本文昌魚、佛羅里達(dá)文昌魚和歐洲文昌魚B.lancelatum。在文昌魚繁殖生物學(xué)研究方面，主要通過野外種群調(diào)查，文昌魚每年有多次產(chǎn)卵，但不同種或同種的不同地理種群的產(chǎn)卵次數(shù)及間隔時(shí)間不同。白氏文昌魚在廈門海域有2次產(chǎn)卵[13,16]；日本文昌魚在有明海南部海區(qū)有2次產(chǎn)卵，兩次之間大約間隔2周[7]，在瀨戶內(nèi)海有3次產(chǎn)卵[17]，在青島海域一年繁殖1次[18]，在廈門海區(qū)有2次產(chǎn)卵[13,16]；佛羅里達(dá)文昌魚在同一個(gè)繁殖季節(jié)里，每間隔1～15 d就重復(fù)產(chǎn)卵[5]，但每個(gè)晚上參與產(chǎn)卵的成體數(shù)量時(shí)多時(shí)少；地中海的歐洲文昌魚不同年份的產(chǎn)卵次數(shù)有1次或2次[10]。種群水平上的多次產(chǎn)卵既可能是不同個(gè)體性腺發(fā)育不同步帶來的分批次繁殖，也可能是同一個(gè)體產(chǎn)卵后性腺重新發(fā)育成熟再次產(chǎn)卵的，或者兩種情況同時(shí)存在。隨著實(shí)驗(yàn)室文昌魚繁育的成功，才有可能觀測個(gè)體水平的繁殖情況，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的白氏文昌魚一年可以產(chǎn)卵2～4次[16,19]，而日本文昌魚一年只產(chǎn)卵1次[16]，本研究佛羅里達(dá)文昌魚從4月份到12月份可以多次產(chǎn)卵繁殖，從4～9次不等，可見不同種文昌魚個(gè)體水平上的產(chǎn)卵頻次有較大的區(qū)別，從產(chǎn)卵頻次看，佛羅里達(dá)文昌魚的繁殖力明顯比較強(qiáng)，選擇它作為水產(chǎn)養(yǎng)殖對象或作為科研模式生物都具有明顯優(yōu)勢。