水稻組蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的克隆及表達分析

賈俊婷，陳兵先，吳柔賢，戴彰言，鐘明生，解 昊，劉雙幸，劉 軍

（廣東省農業科學院農業生物基因研究中心/廣東省農作物種質資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】非核苷酸序列的改變而產生的遺傳變異稱之為表觀遺傳，常見的有組蛋白修飾、染色質重塑和DNA 甲基化等［1］。水稻作為我國重要的糧食作物，對其組蛋白進行深入研究具有重大意義。目前我們對水稻的表觀調控機制仍知之甚少。本研究以水稻組蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719為研究對象，對其進行基因克隆，預測其蛋白質分子結構，并進一步探究該基因與其他不同物種相似蛋白的親緣關系，為進一步解析OsJMJ719基因的功能奠定基礎。【前人研究進展】染色質的基本結構單位是核小體，核小體由146 bp DNA 和堿性核心組蛋白組成。核心組蛋白特定位點的賴氨酸和精氨酸殘基上容易發生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等共價修飾［2］，從而提供表觀遺傳信息，調控染色質的功能，如基因的活性、染色質的結構、表觀遺傳記憶等。組蛋白上的各種共價修飾都是動態的、可逆的酶促反應過程。組蛋白甲基轉移酶和去甲基化酶協同調控組蛋白甲基化。組蛋白甲基化修飾通常發生在組蛋白H3 和H4 N 末端的精氨酸和賴氨酸殘基上［3］。組蛋白賴氨酸去甲基化酶（histone lysine demethylase，KDM）根據其結構特征分為兩大類，一類是以 FAD 為輔因子的LSD1 家族蛋白（lysine specific demethylase 1）；另一類是以亞鐵離子（Fe2+）和α-酮戊二酸（α-KG）為輔因子的JmjC 家族蛋白（JHDM,JmjCdomain-containing histone demethylase），在組蛋白的去甲基化調控過程中起主導作用［4］。相關研究表明，水稻中的JmjC 結構蛋白在調控基因表達、控制水稻發育方面具有一定功能，其編碼基因有20 個，依次為OsJMJ701、OsJMJ702……OsJMJ719、OsJMJ720。根據進化關系JmjC 蛋白可分為5 個亞家族，分別為JHDM1/KDM5 家族、JHDM3/KDM4 家族、JHDM2/KDM3 家族、JMJD6 家族和JmjC domain-only 家族蛋白［5］。近年研究表明，組蛋白去甲基化酶在植物的生長發育、種子萌發和逆境反應等方面都起著重要作用［6-9］。OsJMJ703專一性作用于水稻組蛋白H3K4me2/3，T-DNA 插入突變體與野生型相比，株高降低、二次枝梗減少且粒型發生變化［10］；OsJMJ703也參與干旱脅迫，敲除突變體表現為對干旱的耐受性增強［11］。OsJMJ705是一個特異的水稻組蛋白H3K27me2/3 去甲基化酶，正調控白葉枯病菌抗性基因的表達，還參與水稻生物脅迫應答和生殖過程，表現為突變體植株矮小、結實率下降［12］。在體外OsJMJ706可以導致H3K9me2/3 的去甲基化，其通過調控花發育有關基因，影響小穗發育，導致內、外稃數目改變及雄、雌蕊數改變［13］。OsJMJ714作用于H3K9me1/2/3的去甲基化，調控水稻中多種植物激素如生長素代謝相關基因的表達，造成水稻根系的發育過程紊亂［14］。【本研究切入點】組蛋白H3 末端的甲基化修飾可以抑制或者沉默植物生長發育基因及逆境響應基因的表達，本研究以一個組蛋白去甲基化酶基因為研究對象，研究其啟動子結構、亞細胞定位及在響應非生物脅迫過程中的表達模式。【擬解決的關鍵問題】本研究從水稻品種中花11 中克隆出OsJMJ719（LOC_Os02g01940）基因；通過生物信息學技術對該基因結構、蛋白結構、物種進化樹等進行系統分析；構建其亞細胞定位載體，對其蛋白進行亞細胞定位進行觀察；并利用實時熒光定量PCR 分析其在水稻組織表達模式、不同逆境條件下的表達模式，從而為進一步研究OsJMJ719的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種為粳稻（Oryza sativa ssp.Japonica）ZH11；小葉煙草為本實驗室保存，用于亞細胞定位觀察，在溫度22～23 ℃，光周期為16 h/8 h 條件下培養1 個月后備用。基因克隆載體pMD18-T simple 購于TaKaRa 公司；亞細胞定位GFP 載體pCAMBIA1302 購買于武漢艾迪晶生物科技有限公司、大腸桿菌E.coliDH5α和農桿菌GV1301 為本實驗室保存。RNA 提取試劑盒購自GenStar 公司，反轉錄試劑盒Prime-ScriptTMRT reagent Kit 購自TaKaRa 公司。水稻中花11 兩周大的幼苗，分別使用50 μmol/L ABA、300 mmol/L NaCl、20% PEG、4 ℃低溫、25 μmol/L 乙烯前體ACC 處理1 h 和3 h，取地上部分，設3 個生物學重復，用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻OsJMJ719基因的克隆OsJMJ719（NCBI GenBank 登錄號：XM_015767632.2）預測為Oryza sativaJaponica Group lysine-specific demethylase，根據其保守序列，用Primer 5.0 設計引物，引物序列如下：正向5'-GCCGCAATTTGA TTTGATTTCCTCCTT-3'，反向5'-GCCATCTGAC TGACTCCACAATACAAT-3'。采用TRIzol 法提取植物總RNA，反轉錄，使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase 擴增得到全長產物，RCR反應體系如下：PrimeSTAR Max Primix（2×）25 μL，Primer 1 10 pmol，Primer 2 10 pmol，cDNA 200 ng，添加ddH2O 至總體積為50 μL。反應條件：98 ℃變性3 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 10 s，33 個循環。取20 μL 擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，回收并純化PCR 產物連接載體測序。

1.2.2 生物信息學分析 利用國家水稻數據中心網站（https://www.ricedata.cn/index.htm）獲得OsJMJ719的CDS 序列、啟動子序列和氨基酸序列；在PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網站對基因啟動子區域進行順式作用元件分析；使用 MEGA6.0 對OsJMJ719 蛋白序列和其他物種的蛋白序列進行系統進化樹分析；利用軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對蛋白三維結構進行預測；利用網址Netphos 3.1 ESPASY 對OsJMJ719 的親疏水性進行預測；利用在線網站SignalP6.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP）進行信號肽預測；利用TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行跨膜結構預測；采用Netphos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）網站對OsJMJ719 的磷酸化水平進行預測；使用String 在線網站（https://string-db.org）對OsJMJ719 蛋白與其他蛋白間的互作進行預測。

1.2.3 表達模式分析 以ZH11 為材料，利用qRT-PCR 的方法分析OsJMJ719基因在轉錄水平的表達，具體取材方法如下：不同組織部位（根、莖、葉、劍葉、穗、種子），不同老化階段（人工老化11 d 和14 d 的種子）和不同脅迫處理的材料（50 μmol/L ABA；300 mmol/L NaCl；20% PEG；4 ℃低溫；25 μmol/L 乙烯前體ACC 處理1 h 和3 h），分析OsJMJ719基因的表達模式。設計Real-time PCR 引物，對OsJMJ719基因進行表達模式分析，引物序列如下：正 向5'-GCTGGTACCCGCATCTAACA-3'，反向5'-ACCATCGGCAAACTCCTTGT-3'。定量PCR 按照TaKaRa 公司編號為RR820Q 的SYBR ?Premix Ex Taq ? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書進行操作，使用LightCycler480（Roche,Germeny）定量PCR 儀進行qRT-PCR，反應條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、68 ℃ 30 s，45 個循環。qRT-PCR 反應結束后，使用2-ΔΔCt方法對所得數據進行相對定量分析。

水稻人工老化處理：將種子用紗網袋裝好，置于 15 ℃、相對濕度(R.H) 85% 的密封的干燥器中預處理2 d 后，轉移到已經平衡好的42 ℃、相對濕度85%干燥器中處理5～15 d,然后分別置于25 ℃、32%干燥3 d，密封貯藏于-20 ℃。以未經老化處理且儲存在種質資源長期保存庫（-20 ℃，相對濕度小于50%）的材料為對照。

1.2.4 亞細胞定位分析 分析設計分別帶BglII 和SpeI 酶切位點的引物：正向5'-gaagatctATGCCGC CCAAGAGGAAGCG-3'，反向5'-ggactagtACTAAC ACTTGGGGCAGACGC-3'，以克隆引物測序正確的質粒做克隆模板，克隆OsJMJ719基因的CDS（coding sequence,CDS）區域并連接到 pMD18-T simple 載體上，轉化DH5α，通過測序方法進一步鑒定序列是否正確，確保無移碼現象發生；配制酶切反應液，同時酶切 pCAMBIA1302 及pMD18-Tsimple-OsJMJ719質粒，37 ℃酶切 4 h后，對酶切產物進行電泳檢測，回收及純化酶切目的產物；目標片段OsJMJ719 連接到表達載體pCAMBIA1302，體系為 10 μL，其中OsJMJ719的酶切產物1 μL，酶切后載體pCAMBIA1302 2 μL，雙蒸水2 μL，Solution I 5 μL，在 16 ℃30 min 時，4 ℃放置過夜；轉化 DH 5α 大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆，質粒提取酶切鑒定，獲得pCAMBIA1302-OsJMJ719-GFP 重組質粒。將重組質粒分別轉化水稻和煙草進行表達和亞細胞定位觀察。

2 結果與分析

2.1 OsJMJ719 基因克隆及啟動子作用元件分析

從粳稻品種中花11 中提取總RNA，經過反轉錄得到cDNA，用于基因克隆。在國家水稻數據中心網站搜索OsJMJ719（LOC_Os02g01940）的基因序列，用 Primer 5.0 設計引物，設計克隆引物，以cDNA 為模板對OsJMJ719的CDS（coding sequence,CDS）進行PCR 擴增，測序得到CDS 全長為2 994 bp（圖1），該基因編碼 998 個氨基酸。

圖1 水稻OsJMJ719 基因的克隆Fig.1 Cloning of OsJMJ719 gene in rice

為了解OsJMJ719受到的潛在調控因素，對其啟動子順式作用元件進行預測分析。選取OsJMJ719基因起始密碼子ATG 前2 000 bp 的序列作為啟動子序列，在PlantCARE 網站分析其順式作用元件（表1）。結果表明，在OsJMJ719基因啟動子序列中，存在很多種類的順式作用元件，作用于植物生長調控的多個方面：第一類為啟動子主要順式作用元件，包括CAAT-box（23個）、TATA-box（30 個）；第二類為參與光響應元件和光響應調控元件，包括ACE（1 個）、I-box（1 個）、Sp1（1 個）、Box4（2 個）、G-Box（3 個）和G-box（6 個）；第三類為植物激素響應元件，包括赤霉素響應元件GARE-motif（1 個）、水楊酸響應元件TCA-element（1 個）和脫落酸響應元件ABRE（8 個）；第四類為環境脅迫調控相關元件，包括ARE（2 個）、TC-rich repeats（1 個）；第五類為參與胚乳表達的調控元件GCN4-motif（1個）；第六類為Unnamed_1 元件（1 個），預測其為蛋白結合位點元件。分析表明，OsJMJ719基因啟動子具有光響應相關元件14 個、植物激素響應元件10 個、環境脅迫調控相關元件3 個，推測OsJMJ719可能參與植物生長發育及逆境、激素等外界因素的響應。

表1 OsJMJ719 基因啟動子順式作用元件Table 1 Cis-acting elements in promoter sequence of OsJMJ719

2.2 系統進化樹構建與分析

將OsJMJ719 的蛋白序列提交到NCBI 數據庫，獲得登錄號BFA07558.1；利用BLASTP 工具搜索不同物種中OsJMJ719 的同源序列，用鄰接法構建系統進化樹，聚類后分析發現，OsJMJ719 蛋白首先與水稻（Oryza sativaJaponica）、沼生菰（Zizania palustris）、粗山羊草（Aegilops tauschii）、小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare）的JmjC 基因蛋白序列有較高的同源性，表明水稻與沼生菰、粗山羊草、小麥、大麥親緣關系較近，其次是黑麥草和二穗短柄草（圖2）。

圖2 OsJMJ719 蛋白和其他物種相似蛋白的同源性比對Fig.2 Homology comparison of OsJMJ719 proteins and homologous proteins from other species

2.3 水稻OsJMJ719 的蛋白結構及親水性分析

通過SWISS-MODEL 對OsJMJ719 蛋白的三維結構進行預測，發現該蛋白的三級結構以無規卷曲和α-螺旋為主，其中構成α 螺旋的氨基酸313 個、占31.39%，形成延伸鏈的氨基酸110 個、占11.03%，構成無規則卷曲的氨基酸537 個、占53.86%，β 轉角的氨基酸37 個、占3.71%（圖3A）。利用網址ESPASY 對OsJMJ719 的親疏水性進行預測（圖3B）。圖3B 中，橫軸代表氨基酸序列，縱軸代表親水性平均系數，以0為分界線，數值為正數疏水性越強，數值為負數親水性越強。該段基因編碼的蛋白質親水平均系數為-0.751，推測該蛋白為親水性蛋白質。

圖3 OsJMJ719 蛋白的三維結構（A）和親水性預測（B）Fig.3 Tertiary structure（A）and hydrophilic prediction（B）of OsJMJ719 protein

2.4 水稻OsJMJ719 的跨膜結構及信號肽預測

使用工具TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行OsJMJ719 蛋白跨膜結構預測，結果表明OsJMJ719 蛋白為膜外蛋白，無跨膜區域，也無膜內區域（圖4A）。使用在線網站SignalP 6.0 對OsJMJ719 蛋白是否存在信號肽進行預測，發現OsJMJ719 蛋白存在信號肽的可能性為0.15%，因此OsJMJ719 蛋白不存在信號肽的可能性為99.85%（圖4B）。

圖4 OsJMJ719 蛋白跨膜結構（A）和信號肽預測（B）Fig.4 Protein transmembrane structure（A）and signal peptide prediction（B）of OsJMJ719

2.5 水稻OsJMJ719 蛋白磷酸化水平分析

磷酸化作為一種常見的翻譯后修飾，在能量代謝、信號傳導、神經活動等維持機體細胞的生理過程中發揮作用，是一種重要的調節蛋白質功能的機制。采用 Netphos 3.1 Server 網站對OsJMJ719 的磷酸化水平進行預測（圖5），發現OsJMJ719 含有82 個蛋白質磷酸化位點，其中絲氨酸的預測位點有47 個，最高得分位點是第64位，評分0.998，序列為VADPSSTEL；蘇氨酸的預測位點有29 個，最高得分位點是第28 位，評分0.985，序列為NGEKTNKEE；酪氨酸的預測位點有6 個，最高得分位點是第413 位，評分0.967，序列為DNYIYCPTA。表明OsJMJ719 擁有較多的磷酸化位點。

圖5 OsJMJ719 蛋白磷酸化位點分析Fig.5 Phosphorylation site analysis of OsJMJ719

2.6 OsJMJ719 蛋白互作預測

使用String 在線網站對OsJMJ719 蛋白與其他蛋白間的互作進行預測，以擬南芥為參考，預測結果（圖6）顯示該蛋白可能與SWIB 等6 個蛋白進行互作，以未鑒定蛋白（uncharacterized protein）最多。OsJMJ719 與SWIB 功能聯系綜合得分相對較高，互作的可能性更大。OsJMJ719還可能通過調控綠色未鑒定蛋白，從而間接調控S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC）。

圖6 OsJMJ719 蛋白與其他蛋白間的互作預測Fig.6 Prediction of interactions between OsJMJ719 protein and other proteins

2.7 水稻 OsJMJ719 蛋白亞細胞定位分析

為進一步觀察OsJMJ719 的亞細胞定位，將35S 啟動子所驅動的OsJMJ719 與GFP 進行融合，通過原生質體瞬時轉化法將構建的35S::OsJMJ719-GFP 轉化到原生質體中進行蛋白表達。利用激光共聚焦顯微鏡可以觀察到空載對照35S::GFP 在細胞質、細胞核以及細胞膜中均有表達；OsJMJ719-GFP 的熒光可以在原生質體的細胞核中觀察到細胞質和細胞膜中有極微弱的熒光,因此推測OsJMJ719 蛋白主要定位于細胞核中（圖7A）。同時使用農桿菌轉化法將35S::OsJMJ719-GFP 瞬時轉化煙草，轉染2～3 d 后，進行激光共聚焦顯微鏡觀察。結果顯示，在瞬時表達的煙草下表皮細胞中，GFP 信號和DAPI 信號完全重合，說明OsJMJ719 在煙草瞬時表達系統中定位于煙草下表皮的細胞核中（圖7B）。

圖7 OsJMJ719 蛋白的亞細胞定位分析Fig.7 Subcellular localization of OsJMJ719 protein

2.8 基因表達模式分析

通過對OsJMJ719啟動子作用元件的分析，發現啟動子中有10 個植物激素相應元件和3 個環境脅迫調控元件，為此利用ABA、ACC（乙烯前體）、低溫、高鹽和干旱脅迫處理對OsJMJ719基因進行組織表達和老化的定量分析，發現OsJMJ719在水稻各組織中呈現組成型表達；成熟的種子中高豐度表達，在葉鞘和穗中的表達量較少；且在種子老化過程中表達量顯著下調。在ABA、低溫、高鹽、干旱和ACC 脅迫處理下，中花11 幼葉中OsJMJ719基因的表達模式分析結果如圖10 所示，低溫處理后，水稻OsJMJ719的表達水平開始持續升高，在處理3 h 時的表達水平約為處理前表達水平的6 倍；在300 mmol/L NaCl 脅迫處理下，葉片中OsJMJ719基因在3 h 的表達量上調顯著，約為起始量的15.5 倍；在20% PEG 的處理下，OsJMJ719基因的表達量陸續上升，在處理1 h 時的表達量約為0 h 的4 倍，在處理3 h 時的表達量約為0 h 的10 倍；在50 μmol/L ABA 的處理下，處理1 h 時OsJMJ719基因的表達量與0 h 無差異，在處理3 h 時上調顯著，約為0 h 的8 倍；25 μmol/L 乙烯前體ACC 處理1 h 和3 h 的情況下，OsJMJ719基因的表達量表現為先上升后下降的趨勢（圖8）。

圖8 OsJMJ719 基因的組織表達及不同脅迫處理條件下的相對表達量分析Fig.8 Relative expression level analysis of OsJMJ719 gene in different tissues and under different abiotic stresses

3 討論

組蛋白修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾機制，在植物開花時間調控、果實發育以及逆境脅迫響應中起重要作用［15］。JmjC 結構蛋白作為KDM 家族中重要的一員，可以通過參與組蛋白修飾和DNA 甲基化之間的相互作用，維持體內組蛋白甲基化的穩態，在表觀遺傳過程、基因表達和植物發育中發揮重要作用［16］。

啟動子對基因時空表達的調控具有關鍵作用,對基因的啟動子序列進行分析可為研究基因表達模式和潛在功能提供一定的參考價值。劉圣杰等［17］對一個水稻乙二醛酶基因OsGLYI11.2的啟動子片段進行了克隆和順式作用元件分析，發現該基因的啟動子在水稻的生長發育及逆境脅迫響應中發揮作用。因此，OsJMJ719基因啟動子具有多種植物生長激素、非生物脅迫、光響應調控元件以及逆境相關元件，暗示逆境脅迫、激素及光信號等在一定程度上調節OsJMJ719基因的表達，并且推測OsJMJ719很可能在應對逆境過程中起著重要作用。除此之外，OsJMJ719基因啟動子有調控胚乳表達的元件，說明該基因介導胚乳的表達。在今后研究轉錄調節的分析機制時，可以通過分析啟動子結構及組成和相應的生物學功能，結合植株的表型特性，解析該基因啟動子對植株發育和應對逆境中的作用。

使用String 在線網站對OsJMJ719 蛋白與其他蛋白間的互作進行預測，發現該蛋白可能與SWIB 互作的可能性更大。SWIB 是ATP 依賴的染色體重塑復合物（ATP-dependent chromatin remodeling complex）中SWI/SNF 亞家族的成員［18］。SWI/SNF 染色體重塑復合物介導了的組蛋白與DNA 之間的結合，參與了植物發育和逆境脅迫調節［19］。二者在水稻體內是否發生互作，是否參與染色體重塑復合體的形成，需要我們更加深入的研究。互作蛋白分析結果顯示OsJMJ719 蛋白可以間接與SAMDC 互作。作為多胺合成的關鍵限速酶，SAMDC 主要參與植物防御干旱脅迫的調控過程［20］，因此推測OsJMJ719 可能參與植物的干旱脅迫反應。

在對不同物種的JMJC 蛋白進行分析，可直觀地得到JMJC 蛋白均含典型的JmjC 結構域，且在進化上十分保守，不同物種之間的JmjC 結構域相似度較高。同一個基因家族中，擁有相同保守元件的基因功能有可能相似［21］。隨著不斷深入研究，越來越多含JmjC 結構域蛋白的功能逐漸被挖掘。JMJ17可以通過調控ABA 響應基因促進種子萌發和幼苗生長，也可以參與植物的脫水脅迫響應［22-23］。H3K9 去甲基化酶JMJ27 參與調控干旱脅迫反應［7］。水稻JMJ706可以影響水稻花器官發育和基因MADS-box 的表達［13］，JMJ703可以影響根系菌群［24］。本研究克隆到的OsJMJ719基因編碼的蛋白在序列上與擬南芥IBM1/JMJ25 較為接近，屬于KDM3/JHDM2 家族；IBM1/JMJ25 是一個H3K9me2 和H3K9me1 的去甲基化酶，ibm1突變體植株表現出不同類型的發育缺陷，如葉片變小變窄、花器官發育不正常、花粉敗育和生殖能力降低等表型；JMJ25 亞細胞定位也位于細胞核內［25-27］。通過組織定量表達分析，發現OsJMJ719在成熟種子中表達量較高，且在老化過程中持續下調表達，推測可能在種子萌發、貯藏過程中起重要作用。本研究結果表明OsJMJ719受ABA、NaCl、PEG 和乙烯的誘導表達，OsJMJ719啟動子區域存在與逆境響應相關的元件，暗示OsJMJ719可能參與水稻的非生物脅迫應對過程。本研究后續工作將通過構建OsJMJ719的crispr 敲除和過表達載體，創制突變體和獲得過表達株系，從而驗證OsJMJ719在種子貯藏和非生物脅迫中的功能。

4 結論

本研究從水稻中花11 總RNA 中反轉錄得到cDNA，由此克隆得到1 個JMJC 家族成員OsJMJ719基因，該基因ORF 全長2 994 bp，編碼997 個氨基酸；OsJMJ719 蛋白是不穩定的親水蛋白，與沼生菰、粗山羊草、小麥同源性較高，無信號肽及跨膜區域，擁有較多的磷酸化位點。蛋白質三級結構分析表明，OsJMJ719 蛋白結構以無規則卷曲和α-螺旋為主；亞細胞定位結果顯示該蛋白定位于細胞核。在OsJMJ719基因的啟動子序列中，存在14 個參與光響應元件和光響應調控元件、10 個植物激素響應元件、3 個環境脅迫調控元件，且OsJMJ719基因受ABA、高鹽、干旱和ACC 脅迫誘導均上調表達，推測其可能參與水稻響應多種非生物脅迫，在逆境響應中發揮重要作用。