植物提取物活性成分抗偽狂犬病毒研究進展

房元杰，張曉愛，莫敏瑩，鄧紫璇，施煒濤，魏文康

（1.廣東省農業科學院農業生物基因研究中心/廣東省農作物種質資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225；3.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，廣東 茂名 525000）

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一種有囊膜包裹、基因組大小約為150 kb 的雙鏈DNA 病毒。病毒粒子包含雙鏈基因組、蛋白質外殼、二十面體衣殼以及能插入病毒編碼糖蛋白的脂質包膜［1］。PRV 的編碼結構蛋白有30 多種，其中有6 種衣殼蛋白（UL18、UL19、UL26、UL26.5、UL35、UL38）以及11 種囊膜蛋白（gB、gC、gD、gE 等），這些糖蛋白能侵入包括質膜在內的宿主膜［2-3］。此外，PRV 粒子中還存在許多毒力因子，這些毒力因子在PRV 感染致病過程中發揮作用，如RR基因在急性感染和隱性感染中起關鍵作用；gE基因編碼蛋白可促進病毒與細胞融合，介導病毒在神經系統中傳遞［4-5］；TK基因作為皰疹病毒的主要毒力基因之一，能增強病毒在神經元中的復制能力［6-7］；gG基因可抑制趨化因子結合蛋白；而gD基因是病毒吸附細胞的關鍵基因［8-9］。

PRV 唯一的天然儲存庫是豬。自然條件下，PRV 能感染豬、犬、貓、羊、牛以及多種野生動物和肉食動物，感染人的病例也有報道。1992 年，波蘭報道了人感染偽狂犬病的病例；2021 年，Wang 等［10］報道了我國4 例因PRV 引起人急性腦炎的病例，在人腦脊液中分離到PRV，并總結了PRV 感染人的臨床特征。動物感染PRV 的臨床特征多以神經癥狀和生殖障礙為主。以家豬為例，保育豬、育肥豬感染PRV 會表現精神沉郁、生長停滯，引發呼吸道疾病、細菌病繼發感染等［11］；公豬感染PRV 導致睪丸腫脹、萎縮致性功能障礙，種用能力缺失；母豬感染該病毒會引發流產、死胎；新生仔豬患病會出現明顯的神經癥狀、嘔吐、腹瀉、痙攣等，其中15 日齡以內的仔豬患病致死率高達100%，斷奶仔豬的死亡率為10%～20%，其臨床表現與15 日齡仔豬一致［12］。自豬偽狂犬病被發現后，PRV 在多數歐洲國家、亞洲國家、部分美洲國家流行。2010年以后，國內部分規模化豬場出現PRV 新變異株感染病例，后蔓延至東北、華北、華中地區以及沿海地區多數省份，其中北京、山東和上海為“重災區”，發病率均達40%以上；江西、福建、河南、山西、遼寧、河北省份的發病率也超過30%［13-14］。目前，國內偽狂犬病病毒污染范圍仍然廣泛，在華北、西北、中南及東部地區均存在不同程度感染風險。

當前防控PRV 的有效方法之一是接種疫苗，但新變異株的出現使得單純的疫苗接種已難以有效控制PRV。研究發現，植物提取物活性成分能有效抑制PRV 感染［15-19］。本文綜述植物提取物有效成分抗PRV 活性，以期為將來植物提取物活性成分相關制劑的深入研究及藥物治療防控動物疾病提供參考。

1 植物提取物活性成分

植物提取物是指以植物為原料，按照用途或需要，在不改變提取物有效成分結構條件下，使用物理、化學等方法定向獲取和濃集的植物中某一種或多種有效成分，這些成分包括生物堿、多糖、多酚等天然化合物。

1.1 生物堿

生物堿，即植物堿，是普遍存在于植物體內的含氮次生代謝產物。根據來源不同，生物堿被分為茄科生物堿、毛莨科生物堿、百合科生物堿、罌粟科生物堿等；按其生理作用又分為降壓生物堿、驅蟲生物堿、鎮痛生物堿、抗瘧生物堿等［20］。常用的生物堿分類方法則按照其基本結構，分為有機胺類（麻黃堿、秋水仙堿、益母草堿）、吡咯烷類（古豆堿、野百合堿、千里光堿）、吡啶類（菸堿、檳榔堿、半邊蓮堿）、異喹啉類、吲哚類、咪唑類、喹唑酮類、嘌呤類等。生物堿大多為無色，只有少數（如小檗堿、木蘭花堿、蛇根堿等）為黃色，且具有環狀結構，因此幾乎不溶或難溶于水，但溶于氯仿、乙醚、酒精、丙酮、苯等有機溶劑。生物堿具有止痛、降壓、抗瘧等藥物功效［20］。

1.2 多糖

多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結構復雜但穩定的天然聚合物［21］。多糖可分為同多糖和雜多糖，前者由相同的單糖組合而成，如葡萄糖、甘露聚糖、半乳聚糖等；后者則由不同的單糖組成，如氨基葡萄糖、葡聚糖等。廣義上，多糖還可分為均一性多糖和不均一性多糖。在自然界中廣泛存在的糖原、淀粉、纖維素均為均一性多糖，而常見的不均一性多糖有透明質酸、硫酸軟骨粉、肝素等。多糖具有降血糖、增強免疫、抗癌、抗衰老等生理功效［22］。

1.3 多酚

多酚是一類廣泛存在于植物體內的具有多個羥基酚類植物成分的總稱，包括花色苷類、類黃酮類、黃酮及黃酮醇類、酚酸類等，是植物體內重要的次生代謝產物，具有多元酚結構，主要通過莽草酸和丙二酸途徑合成。絕大多數多酚類化合物為水溶性物質，存在于植物細胞的液泡中，通過與糖結合成糖苷的形式存在。酚酸是一類含有酚環的有機酸，包括單羥基苯甲酸、雙羥基苯甲酸和三羥基苯甲酸（沒食子酸、均苯三酚酸），其中三羥基苯甲酸是可水解單寧酸的成分之一。黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為母核而衍生的多酚化合物，其中包括黃酮的同分異構體及其氫化的還原產物，即以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物。黃酮類化合物廣泛分布于植物界，在植物體內大部分與糖結合成苷類或形成碳糖基，也有部分以游離形式存在。天然黃酮類化合物因母核上常含有羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等助色取代基團而多顯黃色［23］；又因分子中γ-吡酮環上的氧原子能與強酸成鹽而表現為弱堿性，故亦稱為黃堿素類化合物。常見的黃酮類化合物蜂膠、大豆異黃酮、茶多酚等，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、增強免疫等藥理活性［24］。

2 植物提取物不同活性成分抗PRV 活性

2.1 酚酸類化合物抗PRV 活性

酚酸類物質白藜蘆醇（Resveratrol，Res）具有抗病毒活性［25］。研究表明，Res 能抑制PRV復制［26］，在PRV 進入細胞后Res 發揮作用，能大幅降低PRV 復制的相關基因表達水平。Zhao等［27］用不同劑量的Res 給仔豬服用7 d，然后用TCID50為2×106的強毒PRV 感染仔豬，患病仔豬口服3 倍劑量的Res，結果顯示服用Res 組豬只體重上升，且呈劑量依賴性。研究還發現，Res可以增加仔豬血清中干擾素γ 的濃度［27］，證實Res 體外體內對PRV 均具有良好的抗病毒活性。為揭示Res 對PRV 的抗病毒機制，Chen 等［28］用PK-15 細胞感染PRV（MOI=5）后添加不同濃度（3.75、7.5、15 μg/mL）Res，通過RT-PCR 評估病毒即時早期基因（IE180）、早期基因和晚期基因轉錄水平，結果發現Res 不影響IE180表達，但顯著抑制早期基因和晚期基因的轉錄水平。Thr601、Ser603、Pro606 是IE180 蛋白上的3 個活性位點［28］。有文獻報道，IE180 蛋白在細胞質表達后大部分被轉運至細胞核中，激活PRV 的復制過程［29］。Chen 等［28］將載體質粒pcDNA3.1（+）/pIE180/pIE180Thr601Ala/pIE180Ser603Ala/pIE180Pro606Ala與pGL3-TK、pRL-TK 用P3000TM和LipoTM3000試劑盒共轉染后檢測相對熒光素酶活性，結果發現，在0～15 μg/mL 濃度范圍內，Res 濃度越高，對熒光素酶相對活性的抑制越強，表明Res 抑制IE180 蛋白的轉錄活化活性，影響下游基因表達。

山奈酚（Kaempferol，Kge）是一種源自我國南方地區姜科植物的提取物，也被證實在細胞和小鼠體內均表現出良好的抗PRV 特性。Chen 等［30］通過超聲提取制備山奈多酚類化合物，在細胞試驗中表明，當Kge 濃度為12.5～200 μg/mL 時，對PRV 活性的抑制能力從23%提高到90%；對小鼠的實驗結果表明，小鼠感染PRV 后，用Kge 治療能降低小鼠死亡率。在對受感染小鼠器官組織病理學評估中發現，PRV-Kge-L 組中有更多朗格漢斯細胞，而朗格漢斯細胞的作用是捕獲和處理侵入表皮的抗原并將其遞送至T 細胞，這表明Kge在PRV 感染小鼠過程中能調節其免疫能力［30］。此外，Li 等［31］證明Kge 能抑制即時早期基因IE180的轉錄活性，阻礙小鼠體內PRV 復制，并且能誘導白細胞介素（IL-1β、IL-4、IL-6）、TNF-α 以及IFN-γ 表達水平上升。

2.2 黃酮類化合物抗PRV 活性

槲皮素，又稱櫟精，是在植物花、葉和果實中廣泛存在的黃酮化合物。近期Wang 等［32］通過流式細胞術檢測發現，槲皮素通過顯著下調被PRV 感染3D4/2 細胞的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平，從而減緩細胞氧化應激。此外，采用GO 和KEGG 分析該細胞RNA 表達譜發現，對照組和病毒感染組的69 個環狀RNA 以及1 055 個mRNA、867 個IncRNA、99 個miRNA存在差異表達；對照組與病毒-槲皮素組間差異表達的有79 個環狀RNA 及1 202 個mRNA、785個IncRNA、115 個miRNA；而病毒-槲皮素組與病毒組之間差異表達有81 個環狀RNA 以及357個mRNA、69 個IncRNA、111 個miRNA。這 些差異表達的mRNA 參與細胞代謝、抗氧化和蛋白磷酸化等［32］。Wang 等［32］另一個新發現是找到了與抗氧化和氧化應激反應相關的蛋白TXNIP、NOS2，并篩選出SSC-mir-450c-3p 和novelm0400-3p 兩個相關的靶標因子，這為槲皮素抗病毒誘導的氧化應激作用提供了科學依據。Sun等［33］對槲皮素的進一步研究發現，該化合物能插入PRVgD基因底物結合位點中，并通過氫鍵連接N 環和螺旋α3。此外，通過對飼喂7 d 后的PRV 組、PRV 與槲皮素組、PRV+DMSO 組SPF Balb/c 小鼠進行注射100 μL PRV（103TCID50），對照組小鼠注射同體積DMEM，結果一段時間后發現對照組小鼠均存活，PRV+槲皮素組小鼠存活6 只，PRV 組與PRV+DMSO 組小鼠均死亡；經過腦組織病毒DNA 拷貝數測定發現，PRV 組和PRV+DMSO 組小鼠大腦中的病毒含量接近，明顯高于PRV+槲皮素組。該試驗結果表明，槲皮素在體外體內均可抑制PRV 感染［33］。

二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DHY）可分離自多種植物，如粗齒蒿、粗齒莧、顯齒蛇葡萄等，具有良好的抗炎、抗氧化等藥理活性，是治療病毒感染的潛在藥物。Sun 等［34］對PK15 細胞添加DHY 和PRV，結果發現，先加DHY 再加PRV 能干擾病毒與細胞受體結合，阻礙病毒進入細胞；而先加PRV 后加DHY 也能抑制PRV，且當DHY OD570為100 μmol/L 時，抑制率可達87%。此外，通過流式細胞術檢測發現，DHY 顯著降低細胞焦亡相關炎性因子IL-18、IL-1β 的表達水平，這證明DHY 能以干擾病毒入侵以及調控細胞焦亡及其相關炎性因子的表達而抑制PRV 活性。

Liu 等［35］在另一種天然黃酮類化合物木犀草素的研究中發現，木犀草素濃度＜10 μmol/L 時不影響RAW264.7 細胞存活，在木犀草素存在的情況下，病毒感染的RAW 細胞死亡率更低。研究表明，木犀草素可通過抑制STAT1/3 依賴性NF-κB 信號通路的活化，降低通路中p50 蛋白的表達和IL-6 的分泌水平，并誘導Nrf2 介導的HO-1 表達。此外，木犀草素還能減少促炎因子NO 和炎性細胞因子的產生。

2.3 類黃酮化合物抗PRV 活性

Ren 等［36］采用乙醇萃取和乙酸乙酯分餾萃取制備虎杖類黃酮提取物FEA，并在PRV 感染RAW264.7 細胞上建立炎癥模型，檢測NO、ROS產生以及炎癥因子mRNA 表達，以評估FEA 的抗炎活性，結果發現，FEA 能顯著抑制NO 合成，下調COX-2、iNOS和炎性細胞因子的表達和分泌。此外，FEA還干擾了NF-κB p65易位至細胞核中，降低了MAPK 磷酸化，表明FEA 可通過破壞NFκB/MAPK 信號通路相關反應減輕PRV 感染引發的炎癥應激、抑制病毒感染。

源自牛蒿藜的異巴法查爾酮（Isobavachalcone，IBC）對PRV 也具有很強的抑制作用。Wang 等［37］通過熒光素酶表達測定發現，IBC 主要在病毒復制后期發揮作用；通過gB、gH、gL 和EGFP 表達質粒共轉染RK13 細胞進行細胞間融合測定，結果發現IBC 處理后能顯著破壞PRV 介導的細胞間融合。藤黃葉提取物在vero 細胞中也具有殺毒活性。Adnan 等［38］通過使用醋酸乙酯（45L Ea）、乙醇（45L Et）和己烷（45L H）溶劑從藤黃葉中提取生物活性成分，并在vero 細胞上開展評估，結果Ea 提取物濃度為125 μg/mL 時的抗病毒活性最好（75%），其次是Et 提取物（26%），H 提取物對PRV 抗毒活性最低、但細胞毒性最高；Ea 和Et 提取物均能抑制PRV 附著并滅活病毒。Hu 等［39］研究發現，毒魚豆素能阻斷PRV 感染引起的晚期PK-15 細胞凋亡，且在25 μg/mL 濃度下的抑制率最高（90%）。小鼠體內試驗還證實，毒魚豆素在抗PRV、PRRSV、TGEV 以及輪狀病毒等豬源病毒試驗中，以抗PRV 活性最強。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin Gallate，EGCG）是類黃酮物質兒茶素的主要成分，具有多種藥理和生理作用（如抗菌、抗炎、抗病毒等）［40-41］。Huan 等［42］將PK15 B6 細胞分別用10、20、50 μmol/L 濃度EGCG 預處理1 h，然后用MOI=0.1 的PRV XJ5 感染24 h，發現病毒蛋白gE 和UL42 表達降低，且在20、50 μmol/L EGCG 濃度下蛋白不表達；PK15 B6 細胞在20 μmol/L 或50 μmol/L 濃度下使用不同MOI（0.1、0.5、1、2）PRV XJ5 處理24 h，結果顯示50 μmol/L EGCG 可以抑制不同MOI 的PRV 感染；4℃環境條件下研究表明，EGCG可阻斷PRV吸附、入侵PK15 B6 細胞；為研究EGCG 體內抗病毒活性，往BALB/c 小鼠腹膜分別注射20、40 mg/kg劑量EGCG，連續給藥3 d，結果空白組小鼠死亡，而20 mg/kg 劑量組存活率近50%，40 mg/kg 劑量組未出現死亡，表明EGCG 在體外體內均對PRV有抗毒作用。

2.4 多糖化合物抗PRV 活性

多糖是指由同一類單糖或不同的單糖組成的混合物，具有免疫調節、抗病抗癌、降血糖等功能［43-44］。Tong 等［45］從板藍根莖中提取板藍根多糖，并研究其抗PRV 活性，發現板藍根多糖濃度在0.078～0.625 mg/mL 時對細胞無毒副作用。用PRV 感染豬睪丸細胞后添加板藍根多糖，結果發現其對PRV 復制的抑制率在14.674%～30.840%之間；板藍根多糖預處理豬睪丸細胞后用PRV 感染，結果顯示該多糖對PRV 有預防效果，感染率在6.668%～14.923%之間。此外，板藍根多糖能滅活PRV，低濃度（0.078 mg/mL）下能導致32.214%的病毒死亡，高濃度（0.625 mg/mL）則可殺死67.422%的PRV。

揚州大學高松團隊使用車前草多糖（Plantago asiatica Polysaccharide，PLP）研究體外抗豬PRV 活性時發現，PLP 濃度（100、200、400、600 μg/mL）越高，PRV 感染細胞量越少，且病毒蛋白gB 表達水平越低；進一步研究證實，PLP 在病毒復制過程中不發揮作用，且無法殺死病毒，但其能降低細胞內ROS 水平從而抑制PRV［46］。人參多糖（Panax Notoginseng Polysaccharides，PNP）是 從人參根經乙醇提取人參皂苷后余下的殘根廢渣中經過二次提取得到的多糖，能殺傷腫瘤細胞，也能保護機體非特異性免疫和體液免疫反應。研究表明，PNP 不干擾PRV 進入PK15 細胞，但可以阻礙病毒在細胞內的吸附過程，其干擾機制還有待進一步研究［47］。

沙棘多糖（Hippophae Rhamnoides Polysaccharides，HRP）是源于胡頹子科沙棘屬落葉灌木的天然糖產物，研究發現，用1 000 μg/mL HRP 處理PK15細胞，不同MOI（0.1、0.5、1）下PRV 感染細胞1 d，結果MOI 越低抑制效果越好；進一步研究發現，HRP 能同時影響病毒侵入細胞和著陸，但對著陸過程的影響更顯著，且能在一定程度上抑制病毒感染所引起的氧化應激反應［48］。Huan 等［49］研究表明槐耳多糖（Huaier Polysaccharide）也能抑制PRV 進入和吸附PK15 細胞，但在吸附過程中發揮作用更明顯。此外，槐耳多糖還能下調PRV gB 蛋白表達水平，稀釋病毒滴度，破壞病毒囊膜，滅活PRV。

甘草多糖（Glycyrrhiza Polysaccharide，GCP）是從豆科植物甘草中提取得到的一類化合物，其具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、免疫調節等藥理作用［50-51］。研究發現，GCP 不影響豬PRV 在PK15 細胞中的復制和釋放，而是主要抑制PRV感染早期階段，以阻礙PRV 與PK15 細胞結合以及干擾病毒著陸后內化的方式抑制PRV 感染［52］。GCP 在體內抗PRV 的作用及其機制仍有待研究。此外，研究顯示，GCP 須與病毒同時添加才對病毒有抑制效果，這可能會限制GCP 的應用。

2.5 生物堿化合物抗PRV 活性

喜樹堿（Camptothecin，CPT）是一種從我國獨有的珙桐科植物喜樹中提取得到的生物堿類化合物，具有低溶解度、抗癌效果顯著等優點。（S）-10-羥基喜樹堿（10-Hydroxycamptothecin，10-HCPT）是喜樹堿及其衍生物中毒性較低的藥物。Liu 等［53］研究表明，10-HCPT 能抑制PRV復制，選擇性指數為270.04；此外，10-HCPT 通過阻斷病毒基因組復制來發揮其抑制作用，但10-HCPT 不干擾PRV 附著、內化和釋放。RNA轉錄干擾試驗表明，10-HCPT 能阻止DNA 拓撲異構酶（Topo Ⅰ）與病毒DNA 結合成復合物，導致DNA 無法形成雙鏈，復制進程被干擾甚至阻斷，使病毒無法增殖。同時，10-HCPT 可誘導DNA 損傷反應，刺激病毒先天免疫。小鼠體內試驗證實，10-HCPT 組小鼠腦神經病理變化和肺部炎癥情況均比病毒組輕微［54］，表明10-HCPT 能增加INF-β 在小鼠肺部和腦組織中的反應，有效緩解PRV 感染小鼠的組織病理變化。但對于10-HCPT 能否在仔豬體內有效抑制PRV 活性尚不清楚。

2.6 其他化合物抗PRV 活性

據報道，杜邦加大花葉乙醇提取物中含有大量單寧、類黃酮和類固醇等天然化合物［54］，這些化合物對人類和動物病毒都有抗性［55］。估計選擇性指數可以用于評估抗病毒活性潛力。Malik等［56］分別用乙烷、乙醇、乙酸乙酯提取大花葉中的化合物，在vero 細胞上檢測其對PRV 的影響發現，當濃度為62.5 μg/mL 時，乙烷提取物能使病毒完全失活；乙醇提取物也有很好的抗毒特性，使病毒失活率達98%；乙酸乙酯提取物則未表現出任何抑制效果。估計選擇指數顯示，乙醇提取物SI 最高，約為乙酸乙酯提取物的2 倍，這表明杜邦加大花葉乙醇提取物抗PRV 活性效果更好，適合用于動物病毒性疾病藥物的開發。

姜黃提取物吉馬酮也能在體外以劑量依賴性影響PRV 早期復制［57］。Ren 等［58］研究魚腥草注射液對PRV 體外感染的影響，發現當PRV 與魚腥草共同孵育后可抑制PRV 感染，并且在vero細胞上的抑制效果比在豬睪丸細胞上更好；魚腥草在低劑量下能抑制病毒感染誘發的細胞凋亡，但高劑量時其本身會導致細胞凋亡嚴重。目前，有關魚腥草引起的細胞凋亡機制尚未清楚。另有研究發現，馬鞭草甲醇提取物在vero 細胞中以影響病毒吸附的方式抑制PRV 復制［59］。

任氏寡肽-1（Ren’s Oligopeptides-1）是一種植物源抗皰疹病毒藥物。研究發現，在安全濃度下，任氏寡肽-1 濃度為6 mg/mL 時，PRV 蛋白IE180、UL18、UL54、UL21 在感染3、6 h 的表達水平均降低，表明病毒復制受到干擾［60］。任氏寡肽-1 作為天然化合物，在姜、大蒜、苦瓜、香蕉和洋蔥中均可分離到，其毒性小且抗病毒效果好，是治療PRV 的潛在靶標藥物。

3 展望

目前，PRV 依然是我國養豬業的一大威脅，人們普遍采用疫苗手段防控病毒。但研究表明，疫苗防治PRV 具有時效性和局限性，無法提供完全保護。因此，研究和開發新的動物疾病治療藥物至關重要。作為普遍存在于自然界中的植物資源，很多活性成分都顯示出抗病毒活性，而且具備多功能特性，如調節作用、抗應激作用、抗氧化作用、免疫增強作用以及營養作用等。不同提取物活性成分的抗病毒特性是有差異的，這些化合物發揮作用的機制包括抑制病毒復制、滅活病毒、下調病毒蛋白表達水平以及激活相關信號通路等。然而，許多藥物對PRV 抑制機制依然未知，諸如人參多糖對體內PRV 感染的干擾機制和相關信號通路表達機制等。

本文綜述了各種植物提取物活性成分抗PRV 的研究進展及其抗病機制，同時表明植物提取物活性成分對其他病毒的防治也有被廣泛研究［61-64］。植物提取物相對容易獲得，且成本較低，作為藥物預防動物疾病所產生的副作用較小，因此具有廣泛的應用前景。但是，植物提取物存在成分復雜多樣、成分效價不明確、提取工藝不同、活性成分質量難以控制等問題，給其應用與發展帶來挑戰［65］。因此，我們有必要加速開展有效植物活性成分的開發研究，以期將更多具有抗病毒活性的天然化合物應用到動物養殖生產中。