玉米赤霉烯酮液相色譜法與酶聯免疫法測定結果分析

熊永莉，王生華，康 平，洪維暉，伍 君，彭桂萍，雷 彬

（荊門市農產品質量檢驗所，湖北 荊門 448000）

1 ?課題研究背景

玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，能造成動物急慢性中毒，引起動物繁殖機能異常甚至死亡，可給畜牧場造成巨大經濟損失。因此，國家將其列入食品衛生安全監測的必檢項目。目前，檢測機構和相關企業一般采用液相色譜法和酶聯免疫法測定其含量。其中液相色譜法為國家規定的標準方法。液相色譜法雖然測定結果準確，但其測定方法較為復雜，對儀器要求高，成本大，耗時長，嚴重影響了生產經營活動的正常開展。酶聯免疫法具有操作簡單，檢測時間短，顯著節約成本的特點。本研究旨在對以上兩種方法檢測結果進行比較，驗證酶聯免疫法測定結果與液相色譜法測定結果是否一致，從而得出酶聯免疫法的適用性和推廣應用價值。

2 ?實驗過程與步驟

課題研究小組人員分成兩組，對4個含有不同濃度玉米赤霉烯酮的樣品分別用酶聯免疫法和液相色譜法進行玉米赤霉烯酮含量測定。4個樣品分別為：樣品1：小麥標準物質玉米赤霉烯酮含量為58ug/kg±9ug/kg；樣品2：小麥標準物質玉米赤霉烯酮含量為95ug/kg±12ug/kg；樣品3：自備空白基質加標樣品，玉米赤霉烯酮加標濃度為20ug/kg；樣品4：自備空白基質加標樣品，玉米赤霉烯酮加標濃度為150ug/kg。一組實驗人員做酶聯免疫法，另一組實驗人員做液相色譜法，兩種實驗方法具體如下：

2.1 ?酶聯免疫法（某生物技術有限公司生產的玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒）

2.1.1 ? 原理

采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔上預包被玉米赤霉烯酮抗原，樣本中玉米赤霉烯酮和此抗原競爭玉米赤霉烯酮的抗體（抗試劑），同時玉米赤霉烯酮抗體與酶標二體（酶標物）相結合，經底物顯色，樣本吸光值與其含有的玉米赤霉烯酮呈負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣本中玉米赤霉烯酮的含量。

2.1.2 ?設備及試劑

酶標儀（檢測波長450nm）、振蕩器、旋渦儀、天平（精度：0.01g）、離心機、離心管、定量濾紙和漏斗、微量移液器、去離子水、甲醇。

2.1.3 ?溶液的配制

配液1：60%甲醇

用去離子水將甲醇按3：2體積比進行稀釋。

配液2：樣本稀釋液

用去離子水將玉米赤霉烯酮濃縮樣本稀釋液按1：19體積比進行稀釋。

配液3：洗滌液

用去離子水將濃縮洗滌液按1：9體積比進行稀釋。

2.1.4 ?樣品前處理

（1）粉碎并稱取5.0g有代表性的樣品，加入60%的甲醇50ml與其混合；

（2）于振蕩器上劇烈震蕩10min，轉速為150r/min（手搖或者旋渦均需5min）；

（3）取液體于4000r/min離心5min（或者靜置3min，再用定量濾紙過濾）；

（4）取上清或濾液0.5ml，再加入4.5ml去離子水；

（5）振蕩5s或手搖勻，取50ul進行分析。

稀釋倍數：100倍

2.1.5 ? 檢測

（1）將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上。

（2）取出需要數量的微孔板，并記錄下各標準品和樣品的位置，建議均做雙孔平行，未使用的板條用自封袋密封后，立即保存于2～8℃環境，切勿冷凍；

（3）加標準品/樣品溶液50ul到對應的微孔中，在每孔加入50ulZEN酶標物，最后加入50ulZEN抗試劑。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應30min；

（4）揭開蓋板膜，倒掉板孔中液體，在每孔加入250ul洗滌液，充分洗滌4次，每次間隔10s，用吸水紙拍干；

（5）在每孔中加入底物液A，再加底物液B，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應15min；

（6）揭開蓋板膜，在每孔中加入50ul終止液，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻，設定酶標儀在450nm下讀取酶標板吸光度值。

2.2 ?液相色譜法（食品安全國家標準?食品中玉米赤霉烯酮的測定?GB?5009.209—2016第一法）

2.2.1 ? 原理

用乙腈溶液提取試樣中的玉米赤霉烯酮，經免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜熒光檢測器測定，外標法定量。

2.2.2 ?儀器和設備

（1）高效液相色譜儀：配有熒光檢測器。

（2）高速粉碎機：轉速≥12000r/min。

（3）均質器：轉速≥12000r/min。

（4）高速均質器：轉速18000～22000r/min。

（5）氮吹儀。

（6）空氣壓力泵。

（7）玻璃注射器：10ml。

（8）天平：感量0.0001g和0.01g。

2.2.3 ?材料和試劑

（1）材料：玉米赤霉烯酮免疫親和柱（柱規格1ml或3ml，柱容量≥1500ng，或等效柱。）玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5um，無熒光特性。

（2）試劑：甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、吐溫-20、鹽酸。

2.2.4 ?樣品前處理

（1）提取。稱取40.0g粉碎試樣（精確到0.1g）于勻質杯中，加入4g氯化鈉和100ml提取液，以均質器高速攪拌提取2min，定量濾紙過濾。移取10.0ml濾液加入40ml水稀釋混勻，經玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，濾液備用。

（2）凈化。將免疫親和柱連接于玻璃注射器下，準確移取10.0ml上述中的濾液，注入玻璃注射器中。將空氣壓力泵與注射器連接，調節壓力使溶液以1滴/s～2滴/s的流速緩慢通過免疫親和柱，直至有部分空氣進入親和柱中。用5ml水淋洗柱子1次，流速為1～2滴/s，直至有部分空氣進入親和柱中，棄去全部流出液。準確加入1.5ml甲醇洗脫，流速約為1滴/s。收集洗脫液于玻璃試管中，于55℃以下氮氣吹干后，用1.0ml流動相溶解殘渣，供液相色譜測定。

2.2.5 ? 測定

將待測試樣溶液注入高效液相色譜儀，得到玉米赤霉烯酮的峰面積。由標準曲線得到試樣溶液中玉米赤霉烯酮的濃度。

3 ?檢測結果數據比較分析（見表1，表2，表3）

表1 ?酶聯免疫法測定結果統計表

表2 ?液相色譜法測定結果統計表

表3 ?兩種方法檢測結果與真實值的誤差統計表

4 ?實驗結論

通過對4個含有不同濃度玉米赤霉烯酮的樣品，分別用酶聯免疫法和液相色譜法進行玉米赤霉烯酮含量測定，分析比較實驗結果數據，得出如下結論：

（1）兩種方法檢測結果技術指標均滿足實驗標準方法要求。用酶聯免疫法測定，4個樣品檢測結果回收率均在100%±30%范圍內（見表1），滿足實驗要求；用液相色譜法測定，4個樣品檢測結果相對標準偏差均在15%范圍內（見表2），符合標準要求。

（2）酶聯免疫法和液相色譜法測定結果比較存在一定的偏差，不是完全一致的。酶聯免疫法4個樣品檢測結果與樣品真實值之間誤差較大，相對偏差均超過5%（見表3）；液相色譜法4個樣品檢測結果與樣品真實值誤差很小，相對偏差均在5%以內（見表3），結果準確可信。

（3）建議基層檢驗檢測機構和糧食企業可以運用酶聯免疫法進行初篩，提高檢測效率，降低檢測成本，方便生產和經營。對于初篩結果值超過國家規定的限量值或需出具檢驗檢測報告的，則用液相色譜法進行測定，以確保檢測結果的準確性和權威性。