全外顯子測序在Waardenburg綜合征的應用

吳曉麗 吳蓓 嚴樹涓 姜敏敏 馬星衛

(貴州省人民醫院產前診斷中心，貴州 貴陽 550002)

Waardenburg綜合征(Waardenburg syndrome)是一種罕見的遺傳性疾病，臨床表現為聽力正常、單側或雙側中度至極重度聽力損失，聽力損失多是先天性的；頭發、皮膚和虹膜色素沉著，比如白發或頭發過早變灰，白點病，雀斑[1]。Waardenburg 綜合征的臨床表型多樣，即使在同一家庭的不同個體之間，攜帶相同基因突變，也會因臨床外顯率不同或其他原因，使得個體有較大差異[2]。本文報道1例通過全外顯子測序方法，所檢測到MITF基因突變所導致的Waardenburg綜合征，對患者及家系成員提供基因診斷及遺傳咨詢。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，男性，26歲，因“聽力障礙”就診于我院遺傳咨詢門診?；颊邚男‰p耳聽力微弱，隨著年齡增長，聽力越來越弱；目前存在聽力障礙，但未完全喪失聽力。否認幼兒時期有發燒等。核心家系調查，繪制家系圖譜，患者及家屬均簽署知情同意書，進行遺傳病全外顯子測序檢測。

1.2方法 留取患者、其父母及姐姐靜脈血各2 mL，EDTA抗凝。使用德國Qiagen DNA提取試劑盒提取患者及其家系成員的外周血DNA，按照說明書進行DNA提取和保存。首先從受檢者提供的檢測樣本中提取基因組DNA并隨機打斷，然后對外顯子區域進行序列捕獲，最后采用Illumina Hiseq測序儀進行高深度測序。數據分析在基因數據分析解讀平臺Seqmax上完成，總共包括五個步驟：(1)去除低質量reads和接頭序列；(2)將reads比對到參考基因組；(3)變異檢測；(4)變異過濾和注釋；(5)篩選和患者臨床表型相關的基因和變異。變異注釋包含有千人基因組、ExAC、gnomAD、OMIM、ClinVar和HGMD專業版等數據庫相關內容。變異的致病性分級主要基于致病變異數據庫和ACMG指南。由NCBI網站下載MITF基因DNA全序列，采用Primer5軟件設計聚合酶鏈式反應引物。引物序列：正向CTATGCCCAAACCAACTGCT；反向ATGGCAATGTTCCTAGCTTTCTC，PCR產物大小456 bp。PCR反應條件：94℃預熱4 min，共35個循環：94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min，最終擴增延長72℃ 7 min，4℃保存。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后純化，進行雙向測序。

2 結 果

患者，男性，26歲，從小雙耳聽力微弱，隨著長大，聽力越來越弱；目前存在聽力障礙，但未完全喪失聽力。外觀可見雙眼瞳孔呈藍色(圖1)，無視力異常。針對耳聾易感基因SLC26A4、GJB2、GJB3、mtDNA基因測序檢測，均未見突變?；颊郀敔敶嬖诼犃φ系K(已故)；父母無聽力異常；姐姐左耳聽力減弱，右耳聽力正常。詳見家系圖譜(圖2)。經全外顯子測序，MITF基因在chr3:69988315(HG19)存在c.328C>T(p.Arg110Ter)雜合突變。ACMG變異分類：I類致病。相關疾?。篧arrdenburg綜合征II型。進一步使用Sanger測序，患者及家系結果如圖2所示。

圖1 患者眼睛照片

注：Ⅰ1.患者父親，攜帶致病突變；Ⅱ2.患者母親，未攜帶致病突變；Ⅱ1.患者姐姐攜帶致病突變，左耳聽力減弱，右耳聽力正常；Ⅱ2.患者本人，攜帶致病突變，雙耳聽力障礙，虹膜藍色。

3 討 論

Warrdenburg綜合征是一種定義明確、但遺傳異質性的疾病。MITF基因突變在Warrdenburg綜合征中引起相關癥狀的比率大約占27.6%，僅低于PAX3基因突變所占比率48.4%，排名第二位；而在Warrdenburg綜合征II型中與MITF基因突變相關所占比率大約為84.6%；MITF基因突變在Warrdenburg綜合征中約90%患者有聽力損失，其中重度至極重度聽力障礙所占比率超過60%，嚴重程度遠超過PAX3基因突變所致聽力損失[3]。在本研究中，對患者(先證者)通過全外顯子測序手段，檢測到MITF基因的 c.328C>T雜合突變，再進一步對其父母及姐姐進行該位點的家系檢測，患者父親及姐姐攜帶該基因位點突變。該變異所在區域是這個蛋白質的重要組成部分，不同物種的氨基酸序列高度保守。通過動物實驗等研究[4-5]，很大可能是因為MITF基因突變喪失功能所引起的單倍劑量不足，導致相關癥狀出現。

在S.Yang等[6]研究中，在同一家系13人檢測到該突變，但此13人無論在虹膜顏色、皮膚情況、頭發變白、還是聽力損失等各個方面，表現都各不相同，從完全無相關癥狀到極重度耳聾。本研究中，患者表現為中-重度的聽力損失，伴隨虹膜顏色呈藍色，有著與Waardenburg綜合征II型明確相關的臨床表型；但患者姐姐并無虹膜顏色改變，且僅一側聽力減弱，另一耳聽力正常；該患者父親，并無Waardenburg綜合征II型的相關癥狀。與S.Yang等的研究結論一樣，再次驗證了Waardenburg綜合征II型在臨床外顯率差異明顯，有不完全外顯特征。