實驗動物身份識別與追蹤技術在生物安全實驗室的應用前景

陳麗香, 秦波音, 楊 華, 徐春華, 彭秀華, 李 順, 周曉輝

(上海市公共衛生臨床中心,上海 201508)

生物安全實驗室的有效安全管理是保障國家生物安全的重要環節之一。生物安全實驗室內實施有效的生物安全管控已是國家生物安全保障的重要組成部分。在生物安全實驗室中，實驗動物常被用于病原體感染機制等生物醫學研究，以及疫苗與藥物評價等諸多科學實驗，是保障人類健康、安全的特殊試驗品［1］。其中，動物生物安全實驗室應當加強對實驗動物的管理，防止實驗動物逃逸，并且對使用后的實驗動物應進行無害化處理，實現實驗動物可追溯，禁止將使用后的實驗動物流入市場［2］。因此，針對實驗動物進行有效、便捷的標記是保障實驗動物質量、順利開展動物實驗相關的科學研究和實現實驗動物可追溯性管理的基礎［3］，也是實驗動物生物安全管理的重要手段之一。

實驗動物標記方法主要包括染色法、耳標法等傳統方法，以及以二維碼和無線射頻識別技術（radio frequency identification，RFID）為代表的電子標記技術。其中RFID作為物聯網的前端，具有信息量大、無接觸識別等優點［4-5］，目前已被應用于動物飼養管理、樣品跟蹤分析等過程。然而在動物生物安全實驗室中尚未見應用RFID進行實驗動物生命活動全過程跟蹤的報告。本文對生物安全實驗室中動物管理需求及動物識別標記技術的研究現狀進行概述，提示RFID識別技術無需人工干預并可對實驗動物進行實時跟蹤，從而在動物生物安全實驗室的動物可追溯管理中具有重要的應用前景，值得進一步探索推廣。

1 生物安全與實驗動物管理需求

生物安全是指國家有效防范和應對危險生物因子及相關因素威脅，生物技術能夠穩定健康發展，人民生命健康和生態系統相對處于沒有危險和不受威脅的狀態，生物領域具備維護國家安全和持續發展的能力。生物安全實驗室是一種特殊的科學研究實驗室，該類實驗室中主要從事與病原微生物菌（毒）種和樣本有關的研究、教學、檢測、診斷等活動，按操作病原的危害等級和防護水平，可分為BSL-1、BSL-2、BSL-3和BSL-4 四級［6］。由此可知，生物領域內實施有效的生物安全管控已是保障國家生物安全的重要環節。

我國的生物安全實驗室建設起步相對較晚［7-8］。在20世紀80年代后期，我國建成了第一座初步具有生物安全三級防護水平的實驗室（即BSL-3），但當時的生物安全實驗室建設和管理尚沒有統一的標準［9］。2003 年嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）疫情暴發以來，生物安全實驗室的管理問題開始引起我國政府及相關職能部門的高度重視［7］，政府層面陸續修訂或頒布了一系列的要求及法規標準，包括《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《實驗室生物安全通用要求》、《動物病原微生物名錄》、《人間傳染的病原微生物名錄》、《中華人民共和國傳染病防治法》；此外，2016年國家發改委、科技部制定了生物安全實驗室體系建設規劃；2017 年國家衛生和計劃生育委員會發布了衛生行業的《病原微生物實驗室生物安全通用準則》，對管理和技術要求均作了進一步的明確［10］。這些法規標準的發布有力推進了實驗室感染防控力度的加強，降低了實驗室事故發生率，標志著我國步入了法制化管理病原微生物實驗室的軌道。尤為重要的是，2020 年我國在生物安全領域的第一則法律——《中華人民共和國生物安全法》正式頒布（2021 年4 月15 日開始施行），標志著我國生物安全實驗室的建設和管理已經走向成熟階段，該法對我國生物安全實驗室的管理提出了更高的要求。

實驗動物主要是指在特定標準環境下通過人工培育生長繁殖的特殊動物，常被用于生物醫學探索、藥物評價等諸多與生命健康息息相關的科學實驗研究，是不可替代的特殊試驗品［11］。開展動物實驗的生物安全實驗室稱為動物生物安全實驗室，也分為ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3 和ABSL-4 四級［12］。為避免在動物生物安全實驗室內發生動物實驗危險事故，應重點注意三個方面的內容：一是應嚴格按照國家法律法規標準規范等要求使用實驗動物。動物實驗之前應了解實驗擬使用的病原微生物背景，做好人獸共患病的病原污染應急預案，做好防控工作，確保人員健康、環境安全，以便實驗順利開展。二是遵循動物福利標準。在進行動物實驗研究時，盡量減少人為干預，降低對動物的傷害。三是要防止動物逃逸［13］。《中華人民共和國生物安全法》第五章四十七條指出病原微生物實驗室應當在實驗動物方面加強管理和采取防范措施，嚴格控制實驗動物逃逸和遵照國家規定進行實驗動物無害化處理，實現實驗動物生命全過程可追溯；第九章第七十七條指出，如違反生物安全法規定，把使用后的實驗動物流入市場的將進行相應處罰，情節嚴重者甚至會被依法吊銷相關許可證件。由此可見，在動物生物安全實驗室中防止動物逃逸、監管動物去向、實現實驗動物的可追溯管理是目前實驗動物生物安全領域亟需解決的問題。

2 實驗動物標記技術與信息化管理現狀

2.1 傳統實驗動物標記技術

長期以來，為了實現實驗動物的準確識別，保證動物個體之間不被混淆，研究人員采用了多種傳統標記方法。嚙齒類動物實驗常用的標記方法主要有染色法、剃毛法、耳標法、儀器尾部號碼紋身標記法、耳孔法、斷趾法等。但傳統方法有一定的弊端，如染色法主要用于大鼠、小鼠和兔，使用的染料可能存在潛在毒性，易對動物健康及實驗結果造成影響［1，3］；剃毛法主要用于中大型動物如犬、兔，該方法操作簡單，但需要抓取保定，且標記時效短，只能標記少量動物；耳標法適用于多種動物且成本低、可標記數量大的動物群體，但該方法也需要進行動物抓取保定，且耳標存在丟失的風險，此外有研究表明長期佩戴金屬耳標易引起耳部炎性反應等［14］；紋身法需要對動物進行麻醉，使用的染料也可能存在毒性；耳孔法一般適用于嚙齒類小動物如大鼠、小鼠，其對動物有一定傷害，易引起應激反應，另外標記或識別動物時均需要進行動物抓取，工作量大，且需要提前繪制圖譜并進行培訓才可有效識別；斷趾法會導致動物疼痛和傷害，違反動物福利倫理要求，已不被推薦使用［1］。

非人靈長類動物因與人類高度相似，已被廣泛應用于疫苗研究和藥物評價實驗中。傳統的靈長類動物標記方法主要有染色法、套圈法、剃毛法。但毛發染色可能引起動物過敏，剃毛法和染色法的可識別時間都較短，通常不足一個月，限制了它們的使用范圍；而套圈法是指給動物佩戴項圈以進行標記，但項圈的長期佩戴會影響動物行為及健康［1］。

綜上所述，傳統的標記方法識別工作量大，而且需要實驗人員花費大量時間方可完成實驗對應的動物所有信息資料的錄入，容易產生誤寫、誤記現象，影響實驗結果的準確性和可追溯性，已無法適應動物生物安全實驗室中應用場景的發展需求。

2.2 自動識別技術研究進展及在實驗動物領域的應用

當前，物聯網建設已成為國家未來發展戰略之一。在物聯網整個產業鏈中，前端的數據采集與識別技術是實現物聯網的核心關鍵技術。目前在物聯網相關的識別技術中，二維碼和RFID作為自動識別及溯源系統建設的兩大主流技術已經被廣泛應用。條碼識別技術在20世紀80年代末期開始在我國得到一定的推廣［15］，其中的二維碼技術逐漸應用于實驗動物領域，例如在動物耳標上采用條形碼進行動物編號標記［3］等，通過專用識讀器讀取二維碼信息，最終與中央數據庫相連，即可實現動物防疫、檢疫、飼養等環節多種信息的查詢，達到溯源目的。二維碼技術因成本較低，目前已被廣泛應用，但長時間使用二維碼會存在識讀困難的情況，且二維碼無法實現無接觸識別，需要借助耳標等介質，不適宜于活體編碼；尤其在生物安全實驗室，特別是生物安全二級以上屏障系統的動物實驗室內，使用二維碼標記仍無法解決工作量大、暴露風險高的問題。

隨著生物技術和通信技術的發展，目前以RFID為代表的新型識別技術共存的多種技術識別體系已經在實驗動物識別領域逐漸形成。RFID位于物聯網的感知層，技術人員可用它隨時隨地通過無線電訊號識別特定目標，并獲取目標物體的相關信息，因此是一種非接觸式的目標自動識別技術和數據采集技術［16-17］。RFID標簽因具有可讀寫能力、數據存儲量大、經久耐用、非接觸性識別、無需人工干預、環境適應能力好等優點，與現在被廣泛應用的條形碼相比，優勢明顯，已成為自動識別技術的關鍵之一［3，18］。

近年來有研究表明，RFID技術可在畜禽類動物個體行為如畜禽采食、飲水行為、產蛋行為監測方面進行有效應用［19-20］。在實驗動物的跟蹤和數據采集上，RFID技術應用已有以下報道：（1）美國佛羅里達大學實驗室通過RFID標記小鼠籠盒實現5萬只小鼠的溯源管理工作［20-22］；（2）中國臺灣麥德凱生命科學研究所用RFID 標記所有的飼育室、飼育籠架及飼育籠，將RFID應用于實驗動物飼育管理流程，同時也嘗試將主動式RFID芯片植入實驗動物體內，從而建立身份識別系統，進行全時間溯源［20-22］；（3）英國研究者借助小鼠RFID標簽標記技術和紅外視頻采集技術建立了對群體內小鼠個體行為和位置進行實時觀察和自動分析的群體籠盒分析系統（home cage analysis，HCA）［23-24］；（4）加拿大研究者通過將RFID 標簽植入小鼠頸部皮下，并結合體質量測量儀器，建立了可實現多只小鼠體質量測量的自動系統［25］；（5）中國科學院半導體研究所針對動物體溫測量，設計制作了一種新型溫度傳感器，可嵌入RFID標簽并植入動物體內，同時實現目標記別和體溫檢測［26］；（6）為了進行嚙齒類動物模型的行為學研究，德國研究團隊開發出SocialScan動物社交行為分析儀器與RFID 標簽聯合使用的視頻跟蹤技術［27］。此外，RFID 與地理信息系統（geographic information systems，GIS）、全球衛星定位（global positioning system，GPS）相結合，實現動物位置信息跟蹤，也是近年來在電子標記和信息化系統建立技術方面的新突破［28］。如果在生物安全實驗室中對實驗動物進行RFID電子標記，每個動物都相當于一個記錄單元，它的位置信息均可被實時監控，通過系統與手機關聯，下載系統APP 可以隨時無接觸查看動物移動軌跡，如發生變化，可提示飼養人員該動物可能發生逃逸，應及時進行緊急處理。因此，基于RFID等的自動識別技術，在動物生物安全實驗室中有廣泛的應用前景。

3 自動識別技術在動物生物安全實驗室內的應用前景

動物生物安全實驗室，特別是生物安全Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ實驗室均為負壓屏障環境，穿戴相應個人防護裝備的實驗人員操作動物時相對難度更大，實驗室內動物實驗活動一旦未能有效防范危險，與一般實驗室相比，潛在風險和危害巨大，將可能造成嚴重的人員暴露及環境污染。為了進行有效的生物安全防控，實驗室從業人員需要預先對實驗過程中可能存在的各種風險進行評估，并提前采取防控措施，最終達到減少生物安全事件發生以及降低由此帶來的損失的目標［10，29］。在動物生物安全實驗室中，動物相關風險識別的主要環節有以下幾點：（1）動物實驗過程中感染性動物逃逸，導致污染擴散；（2）動物抓傷或咬傷飼育或實驗人員，導致人員感染；（3）動物實驗廢棄物及感染性動物尸體處理不當，導致環境污染及人員感染［30-31］。

在動物生物安全實驗室內，對實驗動物進行RFID標記結合數據采集及分析系統后，可實現無接觸識別、動物信息自動采集；RFID結合實時定位技術，可實時監測動物位置。當發生動物逃逸時，信息系統可以跟蹤動物逃逸位置，有利于防控，能實現及時捕捉，并且通過系統數據分析可獲取動物所有生命信息，得知逃逸動物是否感染病原微生物，便于研究人員制定相應的應急處理措施，有效控制傳染，降低危害。另外，動物生物安全實驗室內生物安全暴露風險較高，頻繁的人員干預不僅不利于生物安全管控，還會引起動物應激反應。運用RFID等無接觸識別技術可以實現生物安全實驗室中實驗動物的身份識別與追蹤，可以減少人員與動物的接觸操作，降低抓咬傷的發生率。此外運用RFID等進行動物標記，建立動物全生命過程監控系統，可跟進監督動物無害化處理過程，防止污染物泄露［11-12］，并且可以實現動物尸體個體化可溯源追蹤和全流程管理，減少尸體處理過程中的不確定因素，避免病原體擴散。未來在生物安全實驗室內進行動物實驗時，通過RFID技術對動物進行標記，每個動物都擁有獨有的數字身份，同時基于實時定位的數據信息系統實現動物位置跟蹤，實現數據采集的自動化及信息可追溯，將是實現生物安全有效管理的重大突破。

此外，除了二維碼技術和RFID技術，2020年中國研究團隊在《iScience》上報告了一套較為完整的動物面部個體識別跟蹤系統：Tri-AI［32］。未來如果該類面部識別系統應用于獼猴等靈長類實驗動物或者豚鼠、兔、犬等動物生物安全實驗室中，也將大大推進實驗動物可追溯系統的建立和生物安全管理。

4 結語與展望

本文對目前的動物標記和識別方法進行了初步分析，從生物安全角度闡述了自動識別技術及可追溯系統建立的必要性。2020 年國家生物安全法出臺，實驗室生物安全問題日益受到社會的廣泛關注。在生物科學研究過程中，對實驗動物引入、實驗、無害化處理等環節進行準確、高效追蹤和管理，將是解決動物實驗生物安全問題的有力保障。

目前自動識別技術和可追溯技術已開始被應用于實驗動物領域，尤其是RFID電子標簽因其可實現從動物出生到死亡的全過程追蹤，并擁有編碼唯一性、可實現無障礙閱讀、數據存儲量大、識別間距遠、讀取率高、防干擾能力較強、可實現個體編碼等特點［15］，已成為國內外自動標記研究及推廣的焦點。未來以RFID技術為識別基礎，融合動物體征感應、體質量測量、實時定位分析等技術的可追溯系統的建立將是生物安全實驗室保障安全管理的關鍵著力點。總之，以RFID等為代表的新型標記技術可實現實驗動物背景信息、實驗信息、無害化處理信息等綜合管理可追溯，在實驗動物領域具有廣闊的應用前景。