抗、感西瓜根系分泌物鑒定及對枯萎病菌生長的影響

張玉錦，周文麗，崔夢嬌，耿二康，苗巧藝，楊嵩涵，呂桂云

（河北農業大學園藝學院 河北保定 071000）

西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporumf. sp.niveum）寄生所引起的一種土傳病害[1]，嚴重降低西瓜的產量及品質，從而導致病田減產，一般減產20%～30%，嚴重可達50%～60%，甚至絕產[2]。已鑒定的生理小種有0、1、2、3，其中生理小種1 為我國優勢小種[3]。目前，西瓜枯萎病常用的防治方法有化學藥劑、嫁接、輪作換茬、抗病育種等[4]，但化學藥劑不能有效防治枯萎病的發生，并且極易造成環境污染；嫁接又操作繁瑣且極易降低果實品質；輪作防治容易受到土地資源的限制；抗病育種因抗病資源匱乏、抗病遺傳規律復雜，現階段商品品種中抗病品種還比較少，還未選育出能抗所有生理小種的品種。因此，枯萎病成為西瓜生產中的主要限制因素之一。

根系分泌物是植物與土壤及土傳病菌相互作用的橋梁，其不僅可以通過改變土壤環境間接抑制土傳病菌，還可以通過自身作用直接抑制土傳病菌[5]。國內外眾多學者對植物根系分泌物進行了研究，發現香蕉抗感品種根系分泌物的酚酸含量在接菌前后發生了改變，接菌后抗病品種特有的對羥基苯甲酸、肉桂酸，以及含量多于感病品種的鄰苯二甲酸都對尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporiumf. sp.cubense）4 號生理小種的生長起抑制作用[6]；抗病棉花品種根系分泌物中綠原酸含量多于感病品種，對病原菌的抑制作用較強，耐病品種根系分泌物中綠原酸含量較少，對病原菌先促進后抑制，感病品種根系分泌物中沒食子酸含量較高，其對菌絲生長有明顯促進作用[7]；甜瓜抗感品種根系分泌物中酚酸種類不同，抗病品種根系分泌物中含有鄰苯二甲酸二丁酯和苯甲酸芐基酯等，對病原菌有抑制作用，感病品種根系分泌物中含有鄰苯二甲酸、丁香酸、苯甲酸等，對病原菌有促進作用[8]。在對棉花枯萎病[9]與煙草黑脛病[10]的研究中，抗病品種根系分泌物抑制病原菌生長，感病品種根系分泌物促進病原菌生長。但關于西瓜抗、感品種間根系分泌物的組分及其與枯萎病菌的相互作用還未見報道。

筆者分別以2 個抗、感西瓜品種為材料，采用水培法和氣相色譜質譜儀分析，研究不同抗性的西瓜品種在接菌與不接菌條件下，根系分泌物的組成成分及其對枯萎病菌菌絲生長、孢子萌發和產孢量的影響，進一步明確根系分泌物接菌前后成分的變化及其對枯萎病菌生長的影響，為闡明根系分泌物與枯萎病菌互作提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

西 瓜 品 種：Sugarlee，SL（抗 病 品 種，R）；Calhoun Gray，CG（抗病品種，R）；早佳8424，ZJ（感病品種，S）；Sugarbaby，SB（感病品種，S）。其中SL，CG，SB 由北京市農林科學院蔬菜研究中心許勇研究員惠贈，ZJ 從山東壽禾種業有限公司購買。枯萎病菌生理小種1（Fusarium oxysporumf. sp.niveumrace 1）由河北農業大學設施實驗室提供，西瓜品種的抗病性已在前期試驗中得到驗證。

1.2 方法

試驗于2021 年3—8 月在河北農業大學創新試驗園內進行。將西瓜種子用紗布包好后在1.5%的次氯酸鈉溶液中浸泡15 min，消毒后洗去黃色，于28 ℃黑暗培養箱中催芽后播種。采用50 孔穴盤育苗，待西瓜2 葉1 心時，換至裝有21 L 營養液（Hoagland）的塑料盒中進行水培，5 d 后進行接菌處理。將生理小種1 接種到PL 培養基中，于搖床培養7 d后，經過菌液過濾、離心，用超純水溶解孢子沉淀并調整濃度到5×108CFU·mL-1。接菌前換新營養液，將孢子液倒入4 個接菌處理組中（Inoculation，In），接菌處理組中的孢子濃度最終為5×106CFU·mL-1[11]，對照的4 個處理組不接菌（Uninoculation，Un），加入等量蒸餾水。共8 個處理組，每個處理3 盒，每盒16 株苗。在處理后的3、6、9、12 d 取樣收集根系分泌物，每組至少取3 株，3 次重復。從營養液中取出幼苗后沖洗根部，將幼苗放入盛有超純水的錐形瓶中，超純水的量需沒過根系[12]。將錐形瓶在陽光下放置4 h 后，倒出溶液并過濾，所得的濾液冷凍干燥至干。由于根系分泌物中所含物質的極性有所不同，因此用丙酮、乙酸乙酯、石油醚、去離子水各3 mL 溶解根系分泌物凍干物，將溶解后的液體混合后放置4 ℃冰箱中。試驗共4 個品種，每個品種進行接菌和不接菌處理，各4 個取樣時間點，每個時間點取樣3 次，共有96 管根系分泌物樣品。

1.3 項目測定及方法

1.3.1 根系分泌物成分分析 將處理后3、6、9、12 d 收集的溶解液各取2 mL，均勻混合后，用GC-MS 檢測溶解液中的成分。所用儀器由Agilent公司提供：6890 GC/5973 MSD，色譜柱為HP-5 MS毛細管柱。以He 作為載氣，1 mL·min-1的流速，1 μL 體積的進樣量。程序升溫到柱溫80 ℃，0.5 min 后以15 ℃·min-1升溫，到230 ℃時停頓0.5 min，以20 ℃·min-1升 溫，到280 ℃時 停 頓20 min 后開始測定。掃描范圍30～600 m·z-1，70 eV轟擊電壓，250 ℃離子源溫，四極桿溫度200 ℃全掃描方式。

1.3.2 根系分泌物對病原菌菌絲生長和孢子萌發的影響 制備PDA[13]培養基，在PDA 不燙手時加入過濾除菌后的根系分泌物，體積比為1∶2，對照組加入等量無菌水，混勻后倒入培養皿中。培養基凝固后在中央接種大小一致的枯萎病菌菌餅，試驗重復3 次，隨后觀察根系分泌物對菌絲生長的影響；調整孢子懸浮液的濃度到1×103CFU·mL-1，將0.1 mL 的孢子懸浮液涂布于PDA 上，封口膜密封后，于28 ℃下倒置培養，7 d 后計算菌落直徑[14]并記錄平板上的菌落數，用于觀察根系分泌物對孢子萌發的影響。

菌絲生長促進率/%＝（處理組菌落面積－對照組菌落面積）/（對照組菌落面積－菌餅面積）×100；

菌絲生長抑制率/%＝（對照組菌落面積－處理組菌落面積）/（對照組菌落面積－菌餅面積）×100；

孢子萌發促進率/%＝（處理組菌落數－對照組菌落數）/對照組菌落數×100；

孢子萌發抑制率/%＝（對照組菌落數－處理組菌落數）/對照組菌落數×100。

1.3.3 根系分泌物對病原菌產孢的影響 在PL 培養基中加入過濾除菌后的根系分泌物，體積比為1∶2，對照組加入等量的無菌水，混勻。將濃度為2×105CFU·mL-1的孢子懸液0.1 mL 加入到PL 培養基中，于25 ℃、125 r·min-1的搖床中培養。7 d 后經過菌液過濾、離心，用去離子水溶解孢子沉淀，在顯微鏡下采用血球計數板記錄3 個相鄰視眼內的孢子數。

孢子產生促進率/%＝（處理組孢子數－對照組孢子數）/對照組孢子數×100；

孢子產生抑制率/%＝（對照組孢子數－處理組孢子數）/對照組孢子數×100。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2016、SPSS 20.0 軟件進行數據分析與作圖，采用Duncan 新復極差檢驗法進行多重比較檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 抗感西瓜品種根系分泌物成分的鑒定

由表1 可知，抗、感西瓜品種根系分泌物中共檢測出10 大類，25 種物質。只在抗病品種根系分泌物中鑒定出的物質為十一烷和苯酚，CG 接菌后十一烷、苯酚分別減少44.13%、100.00%，SL 接菌后十一烷、苯酚分別減少89.12%、59.15%。只在2 個感病品種根系分泌物中共同鑒定出的物質為二十烷、硅烷、棕櫚酸、2-戊烯二酸、癸二酸雙酯、3-羥基-2，4，6-三溴苯甲醛和D-甘露醇。ZJ 接菌后二十烷和D-甘露醇含量分別增加125.93%、88.89%，其他5 種物質含量分別減少100.00%、32.89%、70.00%、43.18%、100.00%；SB 接菌后D-甘露醇含量增加485.71%，其他6 種物質分別減少93.10%、100.00%、40.28%、100.00%、77.78%、90.24%。接菌后感病品種ZJ、SB 中D-甘露醇含量增加，推測D-甘露醇可能與西瓜感病有關。在抗、感品種根系分泌物中鑒定到十八烷酸和鄰苯二甲酸二丁酯，接菌后，抗病品種CG、SL 中十八烷酸含量分別增加79.49%、112.68%，鄰苯二甲酸二丁酯含量分別減少96.33%、25.93%；感病品種ZJ、SB 中十八烷酸含量分別減少6.00%、37.66%，鄰苯二甲酸二丁酯含量分別減少19.67%、24.14%。推測十八烷酸可能與西瓜抗病有關，鄰苯二甲酸二丁酯含量改變可能與病菌侵染有關。綜上，十一烷、苯酚、硅烷、棕櫚酸、癸二酸雙酯、2-戊烯二酸、3-羥基-2，4，6-三溴苯甲醛、鄰苯二甲酸二丁酯等物質含量的改變可能與枯萎病菌侵染有關，十八烷酸可能與西瓜對枯萎病的抗性有關，D-甘露醇可能與感病有關。

表1 西瓜根系分泌物的組成成分

2.2 根系分泌物對病原菌菌絲生長的影響

由表2 可以看出，與對照相比，2 個感病品種未接菌處理3～12 d 的根系分泌物菌落直徑增加了0.90～3.04 cm，促進率為19.87%～67.11%，第3天促進作用最強；接菌后3～9 d 根系分泌物菌落直徑大于未接菌菌落，促進率提高了2.88%～12.36%。與對照相比，抗病品種未接菌處理的3～12 d 的根系分泌物菌落直徑減少了1.84～3.87 cm，抑制率為37.02%～77.87%，第9 天的抑制作用最強；接菌后根系分泌物的菌落直徑小于未接菌菌落，抑制率提高了2.01%～9.26%。感病品種根系分必物對病原菌菌絲的促進作用在前期較為明顯，抗病品種的抑制作用在中期較為明顯。

表2 根系分泌物對枯萎病菌菌絲生長的影響

2.3 根系分泌物對病原菌孢子萌發的影響

由表3 可以看出，與對照相比，感病品種未接菌處理3～12 d 的根系分泌物菌落數增加了2.00～6.00 個，促進率為21.18%～81.82%，第12 天的促進作用最強；接菌后3～9 d 根系分泌物的菌落數多于未接菌菌落，促進率提高了4.55%～22.73%。與對照相比，抗病品種未接菌處理3～12 d 的根系分泌物菌落數減少了1.66～6.00 個，抑制率為13.51%～40.54%，第12 d 的抑制作用最強。接菌后根系分泌物的菌落數少于未接菌菌落，抑制率提高了2.00%～21.62%。

表3 根系分泌物對枯萎病菌孢子萌發的影響

2.4 根系分泌物對病原菌產孢量的影響

由表4 可以看出，與對照相比，感病品種未接菌處理3～12 d 的根系分泌物孢子數增加了1.33～6.00 個，促進率為15.38%～72.00%，第12 天的促進作用最強；接菌后3～9 d 根系分泌物的孢子數多于未接菌孢子數，促進率提高了11.54%～44.00%。與對照相比，抗病品種未接菌處理3～12 d 的根系分泌物孢子數減少了2.34～8.33 個，抑制率為17.11%～58.14%，第12 天的抑制作用最強；接菌后根系分泌物的孢子數少于未接菌孢子數，抑制率提高了2.33%～14.63%。

表4 根系分泌物對枯萎病菌產孢量的影響

3 討論與結論

不同抗性作物品種根系分泌物的組成成分存在差異并且在病原菌侵染下會發生改變，目前發現根系分泌物的組成成分主要有糖類、苯類、酚類、酯類和酸類等[15-17]。在對西瓜叢枝菌根真菌研究中發現，感病品種接種枯萎病菌后，叢枝菌根真菌降低了根系分泌物中琥珀酸和草酸含量，提高了香豆酸和蘋果酸的含量，植株發病減輕，抗性增強[18]。抗枯萎病香蕉品種根系分泌物中乙酸和脯氨酸的含量高于感病品種[19]。抗枯萎病草莓品種根系分泌物中鄰苯二甲酸二丁酯含量高于感病品種，阿魏酸、丁香酸等含量低于感病品種[20]。在對煙草黑脛病的研究中發現，抗病品種接菌后根系分泌物中水楊酸、阿魏酸等含量高于感病品種，酒石酸、月桂酸等含量低于感病品種[21]，其通過抑制病原菌生長增強抗病性。趙媛媛[22]研究發現，接菌后辣椒根系分泌物中正十八烷的含量與抗病性呈正相關。湯麗川等[23]發現，十八碳脂肪酸含量的提高可以抑制大豆種子傳播的莖潰瘍病菌的定殖。黃玉茜等[24]發現，高濃度的花生根系分泌物中，D-甘露醇可作為碳源影響土壤微生物群落結構多樣性，從而導致連作障礙。前人研究發現，根系分泌物中酚類、酸類以及酯類可能與抗病有關，部分酸類可能與感病有關，其可以通過自身作用直接抑制病原菌生長，也可以為病原菌提供碳源促進其生長[25]。在筆者的研究中，抗、感品種根系分泌物組成成分存在差異并且接菌前后發生了改變，其中十八烷酸在抗、感品種根系分泌物中均鑒定到，但接菌后抗病品種CG 和SL 中十八烷酸的含量增加，感病品種ZJ 和SB 中含量減少，可能與西瓜抗病有關，D-甘露醇僅在感病品種根系分泌物中鑒定到并且在接菌后含量增加，可能與西瓜枯萎病感病有關。關于十八烷酸與D-甘露醇在西瓜枯萎病抗感反應中的作用還有待進一步研究。

抗、感品種的根系分泌物對病原菌生長產生的影響不同。Zhang 等[10]研究發現，在煙草黑脛病中，抗病品種根系分泌物在接菌前后對菌落生長和孢子萌發的抑制率分別為30.00%～46.00%和25.00%～40.00%，感病品種根系分泌物未接菌時對病原菌菌落生長的促進率為7.00%～14.00%，而接菌后有輕微的抑制作用（＜5.00%），但對孢子萌發沒有影響。婁曉平等[26]發現，煙草黑脛病中抗病品種根系分泌物對病原菌菌絲生長的抑制率為5.93%～20.78%；感病品種根系分泌物對病原菌菌絲生長的促進率為2.15%～16.47%。李巍等[20]在草莓枯萎病研究中發現，抗病品種根系分泌物對菌絲生長和孢子萌發的抑制率為18.20%～21.40%，感病品種根系分泌物對菌絲生長和孢子萌發的促進率為22.10%～34.50%。抗病品種根系分泌物主要對病原菌菌絲生長、孢子萌發起抑制作用，感病品種根系分泌物起促進作用，并且在棉花黃萎病[27]、煙草青枯病[28]、番茄青枯病[29]上也有類似結論。在筆者的研究中，抗病品種根系分泌物抑制病原菌菌絲生長、孢子萌發與產孢，未接菌抑制率分別為37.02%～77.87%、13.51%～40.54%和17.11%～58.14%，并在接菌后抑制作用增強；感病品種根系分泌物促進病原菌菌絲生長、孢子萌發與產孢，未接菌促進率分別為19.87%～67.11%、21.18%～81.82%和15.38%～72.00%，并在接菌后3～9 d 促進作用增強。接菌后前期根系分泌物對菌絲生長影響較大，后期對孢子萌發與產孢影響較大。

綜上，在筆者的試驗中西瓜抗感品種根系分泌物中共檢測出10 大類、25 種物質，十八烷酸可能與西瓜抗病有關，D-甘露醇可能與西瓜感病有關；抗病品種根系分泌物抑制病原菌菌絲生長、孢子萌發與產孢；感病品種根系分泌物促進病原菌菌絲生長、孢子萌發與產孢，并在接菌后抑制或促進作用增強。