導致CD36缺失的基因新突變CD36c.T200A(p.Ile67Asn)

蔣麗紅，吳國光，陳潔潤，李麗蘭

南寧輸血醫學研究所南寧中心血站，廣西 南寧 530003

CD36 蛋白也稱糖蛋白Ⅳ (GPⅣ)、GPⅢb、GP88、PASⅣ等，相對分子量約88 000[1]，是一種多肽單鏈的跨膜糖蛋白(B 型清道夫受體，SR-B2)，可與多種配基相結合。它在人體內的分布廣泛，在血小板、單核細胞、有核紅細胞、星型膠質細胞、樹突狀細胞、視網膜上皮細胞、心肌和骨骼肌等細胞表面均有表達[1]。它還有脂質配體和蛋白質配體兩大類配體，包括低密度脂蛋白、脂類、脂肪酸、膠原、血小板反應蛋白也是CD36的配體之一。

在生物多樣性進化過程中，部分健康個體中出現CD36 缺失[2-3]。CD36 缺失包括兩類表現型：Ⅰ型缺失，血小板上不表達CD36，單核細胞上亦不表達CD36；Ⅱ型缺失，血小板上不表達CD36，但單核細胞上表達CD36[4]。CD36 缺失個體可通過移植、妊娠或輸血等途徑接觸CD36抗原，引發CD36同種抗體的產生，從而導致免疫性血小板輸注無效、胎兒和新生兒同種免疫血小板減少、輸血后紫癜等同種免疫血小板免疫異常疾病[5-6]。CD36 缺失個體在不同種族、人群中的分布不同，在高加索人中比較少見(0～0.06%)，在中國人群中CD36 缺失個體比例較高為1.8%～4.13%，其中廣西人群中的CD36缺失個體比例高于其他中國地區人群(4.13%)[3，7-11]。本研究在一名廣西CD36缺失個體中發現了可導致CD36缺失的CD36基因新突變，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 先證者為女性，1964 年11 月出生，壯族，為本實驗室在廣西人群CD36缺失分布特征研究中發現并確認的CD36 缺失個體[1]；其女1986 年11月生，壯族；使用EDTA抗凝管采集所有受試者靜脈血5 mL，于-20℃保存待檢。本研究已通過本單位倫理審查批準，并按倫理審批意見征得研究對象知情同意，并簽署知情同意書后采集樣本。

1.2 儀器與試劑 鼠抗人CD36 單抗(美國東南威斯康星血液中心Dr.BrianR.Curtis 饋贈)，鄰苯二胺(丹麥Dako 公司，批號：20002056)，Pure gene DNA Purification Kit(QIAGEN，德國，批號：8850000298)，擴增引物(上海捷瑞生物工程有限公司合成)，TRIZOL(Invitrogen，美國，批號：15596026)，One Step RNA PCR Kit (TaKaRa，日本，批號：AJ30794A)，DNA 膠回收試劑盒(Axygen，美國，批號：15318KE1)，pLV4/StripII-HIS10(深圳盎然生物)，無內毒素質粒小提中量試劑盒(TIANGEN，北京，批號：S8008)，Mem-PERTM Plus試劑盒(Thermo，美國，批號：89842Y)，PCR擴增儀(ABI，美國，GeneAmp9700 型)，凝膠成像分析系統(Bio-Rad，美國，Molecular Imager Gel DocTM XR System)，流式細胞儀(BD 公司)，轉膜儀(美國 Bio-Rad，Trans-Blot Turbo Transfer System)等。

1.3 方法

1.3.1 CD36 表型檢測 運用本實驗室建立[12-13]的血小板流式細胞熒光免疫檢測試驗(platelet immunou fluorescence test-flow cytometry，PIFT-FC)、血小板抗原單克隆抗體特異性免疫固定試驗(monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigen，MAIPA)檢測CD36 于血小板上的表達情況。運用本實驗室建立的單核細胞檢測流式細胞熒光免疫檢測技術(monocyte immunoufluorescence test-flow cytometry，MIFT-FC)[11-12]檢測CD36于單核細胞上的表達情況。

1.3.2 全血DNA和全血總RNA抽提 研究對象血樣 DNA 使用 Pure gene DNA Purification Kit 試劑盒按照試劑盒說明書提取，于-20℃凍存備用。應用傳統的手工TRIzol 法對研究對象的全血總RNA進行抽提，凍存于-80℃備用。

1.3.3 CD36 基因檢測 按照本實驗室建立的方法[13-14]，對先證者及其女兒的CD36 基因(參考序列：NG_008192.1，下同)外顯子3～14進行測序，反轉錄擴增獲取包含CD36 mRNA(參考序列：NM_000072.3，下同)開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)序列全段的cDNA(簡稱 CD36 cDNA)，構建包含 CD36 cDNA 和熒光報告基因EGFP的pLV4/StripII-HIS10真核表達質粒(簡稱CD36-EGFP質粒)后，篩選培養，挑取克隆菌落，經菌落PCR驗證為陽性菌落后，擴大培養陽性菌落，應用質粒抽提試劑盒抽提質粒，并對質粒進行克隆測序。

1.3.4 真核穩定表達細胞株的建立 按本實驗室建立方法[14-15]，將CD36-EGFP真核質粒轉染入CHO-K1細胞系，篩選和建立包含CD36 cDNA轉錄本變異體的真核表達細胞株(MT-CD36 細胞株)，并建立作為下一步蛋白印跡實驗的陽性對照的含有CD36 cDNA野生型轉錄本的真核表達細胞株(WT-CD36 細胞株)，和作為蛋白印跡實驗的陰性對照的僅含EGFP基因的真核表達細胞株(EGFP-細胞株)。對建立并且篩選成功的細胞株進行細胞株總RNA抽提，通過反轉錄擴增測序驗證所建立細胞株對所轉染的目的基因的表達情況。

1.3.5 Western Blot 蛋白印跡驗證實驗 根據參考文獻[14]的方法，應用Mem-PERTM Plus 試劑盒提取上述構建成功細胞株的細胞膜蛋白，并使用Western blot實驗檢測上述建立細胞株的CD36蛋白表達情況。

2 結果

2.1 CD36 表型檢測結果 經MAIPA、PIFT-FC和MIFT-FC 檢測，先證者的CD36 在血小板和單核細胞上均不表達，為Ⅰ型CD36 缺失；CD36 在其女兒的血小板和單核細胞上均呈陽性表達，為CD36 表達陽性個體，見圖1。

圖1 CD36表型分析結果

2.2 CD36 外顯子測序結果 先證者于CD36 外顯子4 中有CD36c.T200A 突變雜合子，其他外顯子3及5～14 均未發現基因突變；其女兒CD36的外顯子3～14中未發現基因突變，見圖2。

圖2 CD36外顯子測序結果

2.3 CD36 cDNA克隆測序結果 先證者包含兩種CD36 mRNA 轉錄本：CD36 c.T200A(p.Ile67Asn)(Gen-Bank的注冊號：HM217022.1)轉錄本變異體和CD36的野生型轉錄本；其女兒只有野生型CD36mRNA 轉錄本，見圖3。

圖3 先證者CD36 cDNA克隆測序結果

2.4 真核表達細胞株的建立結果 成功建立了表達CD36c.200T＞A轉錄本變異體的真核表達細胞株(MT-CD36細胞株)、表達CD36野生型轉錄本的真核表達細胞株(WT-CD36 細胞株)和僅表達EGFP 熒光報告基因的真核表達細胞株(EGFP-細胞株)，并通過mRNA的逆轉錄擴增測序驗證，比對細胞株mRNA逆轉錄產物cDNA和轉入質粒的目的基因片段，結果顯示所建立的細胞株所表達的CD36cDNA序列或/和EGFP基因序列與轉染的基因片段均一致，比對結果見圖4和圖5。

圖4 所建立的真核表達細胞株CD36 cDNA 與轉入質粒CD36 cDNA目的片段電泳結果

圖5 所建立的真核表達細胞株CD36 cDNA 與轉入質粒CD36 cDNA目的片段測序結果比對

2.5 Western blot 蛋白印跡驗證結果 所建立的MT-CD36細胞株和陰性對照EGFP-細胞株的CD36蛋白表達為陰性，而陽性對照WT-CD36 細胞株CD36 蛋白表達為陽性，見圖6。

圖6 Western blot蛋白印跡實驗結果

3 討論

人CD36 基因全長32 Kb，位于常染色體7q11.2上，含有15個外顯子。其中外顯子3～14編碼CD36蛋白，所編碼的CD36蛋白由472個氨基酸組成[14]。目前已報道的有超過40 個基因突變可導致CD36 缺失，基因突變有多種形式，包括單核苷酸取代、堿基插入、堿基缺失及mRNA 剪切加工中的外顯子跳讀等[14，16-17]。本研究在廣西CD36缺失的個體中發現了一個可導致CD36 缺失的 CD36 基因新突變 c.T200A(p.Ile67Asn)，并探討其導致CD36缺失的分子生物學基礎。

該CD36基因新突變被發現于一名廣西壯族女性個體，其CD36 表型經檢測鑒定為Ⅰ型CD36 缺失，即血小板和單核細胞上的CD36表達均缺失。為探索該個體CD36 缺失的分子生物學基礎，本研究分別從DNA和mRNA水平進行研究分析，在DNA水平，針對涉及編碼CD36蛋白的CD36外顯子3～14進行測序檢測，發現先證者具有CD36 c.200T＞A 突變雜合子，該突變位于CD36 外顯子4 上。在mRNA 水平，通過CD36 cDNA克隆測序檢測，探討該個體CD36轉錄遺傳信息的變化情況，發現先證者攜帶有CD36 c.200T＞A轉錄本變異體(GenBank的注冊號：HM217022.1)和CD36野生型轉錄本等兩種mRNA 轉錄本，其中CD36c.200T＞A 轉錄本變異體可導致所編碼CD36 蛋白的第67位氨基酸由異亮氨基酸(Ile)變為天冬酰胺(Asn)。

本研究通過建立真核表達細胞株和Western blot實驗探討CD36 轉錄本變異體c.200T＞A(p.IIe67Asn)對CD36 蛋白表達的影響，確證了攜帶CD36 c.200T＞A轉錄本變異體的真核細胞株(MT-CD36細胞株)不表達CD36，而攜帶野生型CD36 轉錄本的真核表達細胞株的CD36表達為陽性，證實該CD36 mRNA轉錄本變異體可導致CD36 表達缺失，是CD36 新突變c.T200A(p.Ile67Asn)導致CD36缺失的分子生物學基礎。在文獻報道中[1，13-14，20]，單位點的 CD36 雜合突變雜在 CD36Ⅰ型缺失個體、Ⅱ型缺失個體，以及CD36表達陽性個體中均有發現，這可能是由于不同個體間存在不同轉錄調控機制所致[1，14，18-19]。本研究的Ⅰ型CD36缺失個體，具有單個位點的CD36 DNA突變雜合子(CD36 c.200T＞A)，其CD36 mRNA轉錄本包含了該位點的突變型轉錄本變異體和CD36 野生型轉錄本，最終CD36表達卻表現為Ⅰ型CD36缺失，這可能由于該個體中CD36 c.200T＞A突變型轉錄本的轉錄表達占據優勢而最終導致該個體表現為CD36表達缺失，這仍需進一步研究和探討。

在先證者的家系調查中，其女兒未遺傳來自先證者的CD36突變基因，CD36表達為陽性。很遺憾由于先證者父母已過世，而其丈夫和兄弟姐妹等其他家系成員經反復動員均不同意提供樣本參加本研究，因此未能展開深入的家系調查。

由于人群多態性原因，不同人群中導致CD36 缺失的CD36基因突變特征有所不同，在非洲CD36缺失個體中，以c.975T＞C 突變的頻率最高，而在日本則以c.268C＞T 和 c.329_330del 突變最為常見[7]。在我國，LIU等[3]對來自我國吉林、山西、云南、貴州、青海、廣東等地獻血者開展的CD36 缺失的相關研究中，檢測到的 82 例 CD36 缺 失 個 體 中 ，以 329-330delAC 和1228-1239delATTGTGCCTATT最為常見；在廣西目前已報道的抗-CD36介導的血小板同種免疫案例，具有的 CD36 基因突變包括 c.380C＞T、c.329-330delAC、c.1156C＞T等[17]，研究并在廣西CD36缺失個體中發現了多個可導致CD36 缺失的新突變如c.538 T＞C、c.430-1G＞C、c.1006+2T＞G等[13-14，20]。本研究是在廣西CD36 缺失個體人群中發現的又一個可導致CD36 缺失的基因新突變，CD36 基因突變的多樣性及陸續發現的新突變體現了廣西地區導致CD36 缺失的CD36基因突變具有其獨特的人群特征。

綜上，本研究在廣西地區的1名壯族Ⅰ型CD36缺失個體中，發現了1 個CD36 基因新突變c.T200A(p.Ile67Asn)(GenBank:HM217021.1)，其可導致 CD36 缺失，本研究的結果為中國人群導致CD36 缺失的分子基礎研究提供了實驗和理論依據。