重組豬α干擾素對豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）陽性血清中和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）影響的研究

魏波，叢雁方，祝俊鵬，劉曉婧，蔣貽海

（青島蔚藍生物股份有限公司，山東 青島 266114）

0 引言

干擾素是動物抵御病毒入侵的第一道防線，是動物機體感染病毒或接種疫苗后產生的一類具有抗病毒和免疫調節功能的蛋白[1-2]。目前將干擾素分為3類，它們根據核苷酸序列、與特定受體的相互作用、染色體位置、結構和物理化學性質進行分類[3]。 重組豬α干擾素（recombinant porcine interferon-a，rPoIFN-α）是利用大腸桿菌原核表達的一種重組蛋白，具有天然豬α干擾素抗病毒活性[4]。

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種以母豬不孕、晚期胎兒木乃伊、流產、死胎和弱胎、對仔豬產出后發生呼吸道疫病和繼發感染而很快死亡的傳染病[5]。有報道重組豬a干擾素（rPoIFN-a）制劑可以治療高致病性豬繁殖與呼吸綜合征[6]。成功開發rPoIFN-α制劑，主要在體外細胞水平驗證rPoIFN-α對PRRSV陽性血清中和PRRSV的影響作用，為rPoIFN-α應用在PRRSV防控和凈化上提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）TCID50為10-6.89/mL、PRRSV陽性血清（中和效價為1∶37.6）、rPoIFN-α、Marc-145細胞、MDBK細胞由青島蔚藍生物制品有限公司保存。

1.2 方法

1.2.1 rPoIFN-a的活性測定

采用細胞病變抑制法。按常規方法將MDBK細胞傳代，進行細胞計數，滴加96孔板。待細胞長至單層。用含2.0%血清的DMEM培養基將被檢樣品作10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7共4個稀釋度，每個稀釋度接種5孔，0.1 mL/孔，在37 ℃、含5% CO2培養箱中培養18～24 h。棄去上清液，每孔加入水皰性口炎病毒（VSV）0.1 mL（約100TCID50），另設病毒對照孔和正常細胞對照孔，各5孔；在37 ℃、含5% CO2培養箱中培養。待病毒對照孔75%以上細胞出現病變時，判定記錄結果。按Reed-Muench法計算，能保護半數細胞不發生病變的最高稀釋度即為干擾素效價（生物學活性）。比活性為生物學活性與蛋白含量之比。

1.2.2 rPoIFN-a增強PRRSV陽性血清對PRRSV病毒的中和作用

（1）PRRSV陽性血清工作液的制備。PRRSV陽性血清倍比稀釋，選擇2-5、2-6、2-7、2-8共4個稀釋度試驗。

（2）PRRSV病毒工作液的制備。PRRSV以無血清DMEM培養液稀釋至2×105TCID50/100 μL、2×104TCID50/100 μL、2×103TCID50/100 μL、2×102TCID50/100 μL病毒滴度，即病毒工作液。

（3）rPoIFN-a工作液的制備。rPoIFN-a工作液稀釋為20 000 U/mL。

（4）每個試驗組作4個復孔，具體樣品分組如下：①正常細胞對照組：200 μL/孔的無血清DMEM培養液。②PRRS病毒對照組：PRRSV病毒工作液100 μL/孔+無血清DMEM培養液100 μL/孔。③Ab組：PRRSV陽性血清100 μL/孔+PRRSV病毒工作液100 μL/孔。④IFN組：rPoIFN-a工作液（20 000 U/mL）100 μL/孔+PRRSV病毒工作液100 μL/孔。⑤Ab+IFN組：（PRRSV陽性血清50 μL+40 000 U/mL rPoIFN-a工作液50μL）100 μL/孔+PRRSV病毒工作液100 μL/孔。

（5）中和。將所有樣品混勻后置37 ℃中和1 h。

（6）接種細胞。樣品中和后每孔各取200 μL平行加入提前準備好的Marc-145細胞96孔培養板。置37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養5～7 d，觀察細胞CPE情況。

2 結果與分析

2.1 MDBK/VSV系統的rPoIFN-a活性測定結果

采用細胞病變抑制法，檢測系統為MDBK/VSV細胞系統，通過重復試驗計算出rPoIFN-a的活性效價為107.5U/mL。

2.2 rPoIFN-a增強PRRSV陽性血清對PRRSV病毒的中和作用

單獨加IFN組可以中和103個TCID50PRRSV，Ab組中和效價1∶1.175可以保護103TCID50PRRSV感染孔沒有病變。Ab+IFN組在1∶0.588和1∶1.175時均可以完全保護104TICD50PRRSV感染，同時保護3/4的孔數105TCID-50PRRSV未感染。由此得出，1∶0.588和1∶1.175的Ab+IFN組明顯增強Ab中和病毒的能力，見表1。

表1 rPoIFN-a增強PRRSV陽性血清對PRRSV的中和作用

3 討論與結論

rPoIFN-α在體內和體外對PRRSV均敏感，考慮干擾素可以作為抗病毒藥物PRRS病疾進行緊急預防和治療。豬感染PRRSV后，能使失活干擾素啟動子刺激元件并且抑制干擾素調節因子的細胞核轉位，抑制豬體內IFN-α/β的產生，使豬體內檢不出IFN-α。體外試驗證明IFN-α能抑制PRRSV在Marc-145細胞上增殖[7]。本研究結果同早期應用rPoIFN-α可以活化JAK-STAT通路，從而產生抗病毒蛋白抑制PRRSV的增殖結論相符。

本試驗中每孔rPoIFN-α可以抑制103個TCID50PRRSV的增殖，PRRSV陽性血清在達到1∶2.35時也可以完全中和105個TCID50PRRSV病毒，但在PRRSV陽性血清中和效價在1∶0.588，協同加上rPoIFN-α，中和PRRSV的能力會保護到105個TCID50PRRSV病毒的3/4的孔數。其中可以看到單獨加rPoIFN-α可以保護103個TCID50孔未感染。PRRSV陽性血清中和效價1∶1.175，試驗孔的保護未感染趨勢是一樣的。由此得出rPoIFN-α會增強PRRSV陽性血清中和PRRSV的能力。