非糊化條件對小麥蛋白肽酶法制備的影響

安廣杰，衛(wèi)夢雅，王章存*，趙學偉，賀志錚，李秀芳

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001；3.河南省冷鏈食品質(zhì)量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001）

小麥是我國的主要糧食作物，近幾年全國小麥產(chǎn)量超億噸。但目前小麥面粉食品的消費量卻呈現(xiàn)下降趨勢。因此小麥深加工和資源轉(zhuǎn)化成為我國小麥利用的主要研究方向。

小麥面粉主要由淀粉和蛋白質(zhì)組成。淀粉具有糊化、回生、凍融穩(wěn)定性、凝膠性等功能特性[1]，可作增稠劑、穩(wěn)定劑和脂肪替代品等；谷朊粉是小麥蛋白質(zhì)常用的商品名稱[2]，主要由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，具有黏性、彈性、延伸性、成膜性和吸脂性，但因其疏水性強、溶解度低，應用范圍有限[3]。谷朊粉含有豐富的蛋白肽，蛋白肽中的谷氨酰胺具有多種生理功能，如抗氧化[4-5]、解酒[6]、免疫調(diào)節(jié)[7-8]、降血糖[9]、保護腸黏膜[10-11]、促進胃黏膜修復[12-14]等，是其他任何蛋白質(zhì)無法比擬的優(yōu)質(zhì)蛋白，不僅在食品領(lǐng)域有廣泛用途，也可大量用于動物營養(yǎng)的添加，市場前景廣闊[15]。

目前小麥蛋白肽的生產(chǎn)是以高純度的小麥蛋白為原料，通過加入不同蛋白酶水解，將大分子蛋白質(zhì)降解為不同長度的小分子（即蛋白肽）。生產(chǎn)小麥蛋白肽的過程需要較長的工藝路線和較為復雜的生產(chǎn)設(shè)備，且消耗大量的水，并產(chǎn)生大量廢水，造成嚴重的環(huán)境污染，而且，谷朊粉的干燥過程需要消耗大量的能量[16-17]。因此，市場以及企業(yè)迫切需要新的工藝技術(shù)來生產(chǎn)小麥蛋白肽，從而為小麥資源轉(zhuǎn)化開發(fā)新的市場和道路。

聯(lián)合制備淀粉糖和小麥蛋白肽的工藝是以小麥面粉為原料，采取先用蛋白酶水解生產(chǎn)蛋白肽，經(jīng)離心分離后，再用淀粉酶水解淀粉生成相應的淀粉糖，省去了單純生產(chǎn)小麥淀粉和谷朊粉的過程，簡化了生產(chǎn)工藝流程，可大大減少設(shè)備投資、縮短生產(chǎn)周期、實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)、提高生產(chǎn)效率[18]；生產(chǎn)過程也大大減少了水的用量和排放，有利于減少環(huán)境污染，實現(xiàn)綠色化生產(chǎn)[19]。目前還未出現(xiàn)此工藝的相關(guān)文獻報道。作者是在此研究的基礎(chǔ)上，以小麥面粉為原料，以小麥蛋白肽純度、得率等為指標，研究了不同浸泡預處理工藝和不同酶對制備小麥蛋白肽的影響，為小麥蛋白肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面粉：購于中糧面業(yè)集團（蛋白質(zhì)9%，碳水化合物75%，脂肪1.5%，均為質(zhì)量分數(shù)）；Alcalase 2.4 L：丹麥諾維信公司產(chǎn)品；中性蛋白酶（200 000 U/g）：索萊寶（北京）公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司產(chǎn)品；UV-8100 B 型紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司產(chǎn)品；FD-1-50 型真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 工藝路線及實驗內(nèi)容采用兩種工藝路線（見圖1）生產(chǎn)小麥蛋白肽，兩者主要區(qū)別在于浸泡處理（55 ℃，2 h）和加酶順序不同。采用堿性蛋白酶時，pH 為8.5；采用中性蛋白酶時，pH 為7。

圖1 工藝路線Fig.1 Process route

首先，通過考察不同工藝路線下蛋白酶水解效果，得到最佳工藝路線。其次，在路線中依次改變浸泡溫度和浸泡時間，通過對酶解物中蛋白肽純度、得率、水解度和還原糖質(zhì)量分數(shù)的分析，比較兩種酶的水解效果。

1.3.2 酶水解實驗按照工藝路線2 設(shè)定單因素實驗的基本條件為：面粉與水按1 g∶7 g 混合，浸泡溫度為50 ℃，浸泡2.5 h 后調(diào)pH 并加酶酶解，加酶量為1.2%（質(zhì)量分數(shù)），以淀粉質(zhì)量計，酶解時間2 h。

以蛋白肽純度、得率、水解度和還原糖質(zhì)量分數(shù)為指標，不加酶組為對照組，分別考察浸泡溫度、浸泡時間對兩種酶水解效果的影響。各因素梯度設(shè)定：浸泡溫度分別為：45、50、55、60、65 ℃；浸泡時間分別為：1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。

1.3.3 蛋白肽純度和得率測定采用Folin-酚試劑法[20]測定上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，并依此計算蛋白肽純度和得率。

式中：P為蛋白肽純度，%；M1為上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；M2為上清液中固形物總質(zhì)量，g；Y為蛋白肽得率，%；M3為初始樣品總蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g。

1.3.4 水解度測定采用OPA（鄰苯二甲醛）法[21]測定，水解度按下式計算：

式中：DH 為水解度，%；h為被水解的肽鍵數(shù)；htot為蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)。

1.3.5 還原糖的測定為了驗證蛋白酶中含有少量的淀粉酶可以酶解淀粉產(chǎn)生還原糖進入上清液。采用斐林試劑法[22]測定上清液中還原糖質(zhì)量分數(shù)。根據(jù)下式計算還原糖質(zhì)量分數(shù)：

式中：C為還原糖質(zhì)量分數(shù)，%；M4為上清液中還原糖質(zhì)量，g；M5為初始樣品總糖質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸泡預處理工藝對兩種酶制備小麥蛋白肽的影響

為了滿足不同的生產(chǎn)要求，考察了堿性蛋白酶和中性蛋白酶兩種酶的水解效果。

2.1.1 對堿性蛋白酶水解效果的影響兩種工藝路線下堿性蛋白酶水解效果 （包括蛋白肽純度、得率等）見表1，工藝路線2 得到的蛋白肽純度明顯比路線1 高，但兩種路線的蛋白肽得率和水解度差異較小，另外路線2 的上清液中還原糖質(zhì)量分數(shù)明顯較路線1 低。這可能是因為浸泡處理前加酶，淀粉和蛋白質(zhì)還未分離，難以進行酶解，且隨著酶解時間的增加，蛋白酶活力下降，酶解效果減弱，但在浸泡處理后加酶，淀粉顆粒膨脹，體積增大，反而使蛋白質(zhì)分散度增加，與酶結(jié)合概率增大，酶解效果得到提升[23-24]，因此，工藝路線2 即浸泡處理后加酶水解效果較佳。

表1 兩種工藝路線下堿性蛋白酶水解效果Table 1 Effect of alkaline protease hydrolysis under two processes

兩種工藝路線的蛋白肽純度都不高，一方面可能是因為還原糖的存在，另一方面可能是因為淀粉吸水膨脹使黏度增加，導致蛋白質(zhì)被包裹其中難以分離，上清液中蛋白質(zhì)減少。

2.1.2 對中性蛋白酶水解效果的影響兩種工藝路線下中性蛋白酶水解效果見表2，工藝路線2 得到的蛋白肽純度和得率明顯比路線1 高，但路線2的蛋白質(zhì)水解度明顯較路線1 低，且路線2 的還原糖質(zhì)量分數(shù)與路線1 相比較小。

表2 兩種工藝路線下中性蛋白酶水解效果Table 2 Effect of neutral protease hydrolysis under two processes

比較表1和表2可知，中性蛋白酶水解得到的小麥蛋白肽純度和得率都較堿性蛋白酶高，并且堿性蛋白酶對還原糖質(zhì)量分數(shù)影響較顯著，而中性蛋白酶影響較小。其中原因可能是堿性蛋白酶含有少量淀粉酶能夠水解淀粉產(chǎn)生還原糖，導致肽純度降低。因此，以蛋白肽純度和得率為指標，考察兩種工藝路線下中性蛋白酶水解效果，得出工藝路線2 即浸泡處理后加酶提取小麥蛋白肽效果最佳。

其中，中性蛋白酶水解所得蛋白肽純度較堿性蛋白酶高，但總量仍然較低，這可能是因為盡管還原糖質(zhì)量分數(shù)較低使其純度較高，但淀粉的黏度增加導致了上清液中蛋白質(zhì)減少。

2.2 浸泡溫度對酶水解效果的影響

2.2.1 對蛋白肽純度的影響不同蛋白酶水解所得小麥蛋白肽的純度見圖2，小麥蛋白肽的純度都隨溫度的升高先上升后逐漸下降，在50 ℃時分別達到最高值。這可能是因為在45～65 ℃存在一個臨界點溫度，在臨界點溫度前，蛋白肽被部分糊化的淀粉包裹[25-26]，難以分離，因此純度較低；在臨界點時，淀粉顆粒膨脹，體積增大反而增加蛋白質(zhì)分散度，使其更易被酶解，因此純度升高；但高于此溫度，糊化度升高，蛋白質(zhì)逐漸變性，黏度增加，膨脹的淀粉顆粒難以分離并發(fā)生酶解反應，酶活力也在逐漸下降[27-28]，上清液中蛋白質(zhì)減少，蛋白酶中淀粉酶活力逐漸上升，還原糖質(zhì)量分數(shù)升高，因此，小麥蛋白肽純度降低。臨界點溫度為50 ℃。

圖2 浸泡溫度對蛋白肽純度的影響Fig.2 Effect of soaking temperature on peptide purity

2.2.2 對蛋白肽得率的影響不同蛋白酶水解所得蛋白肽得率見圖3，蛋白肽得率都隨著溫度升高先增加后逐漸減少，但中性蛋白酶水解效果更佳。由圖2可知，50 ℃為臨界點溫度，此時蛋白質(zhì)分散度增加，更易被酶解，得率最高，但高于此溫度，淀粉逐漸膨脹，黏度增加，與蛋白質(zhì)難以分離，酶活力也在高溫下逐漸失活，上清液中蛋白質(zhì)減少，因此得率逐漸降低。

圖3 浸泡溫度對蛋白肽得率的影響Fig.3 Effect of soaking temperature on peptide yield

2.2.3 對蛋白肽水解度的影響不同蛋白酶作用下蛋白肽水解度見圖4，蛋白肽水解度都隨著溫度升高先增加后逐漸減少，這可能是因為臨近50 ℃，蛋白質(zhì)的分散度增加，使其更易被水解，因此水解度逐漸增加，但高于50 ℃，酶逐漸失去活性，淀粉顆粒膨脹，黏度增加，吸水量變大，與蛋白質(zhì)難以分離[29]，小肽難以進入上清液，因此，上清中蛋白質(zhì)減少，使其水解度逐漸下降。

圖4 浸泡溫度對蛋白肽水解度的影響Fig.4 Effect of soaking temperature on peptide hydrolysis degree

2.2.4 對還原糖質(zhì)量分數(shù)的影響由于提取過程中存在部分雜質(zhì)和糖進入酶解物，因此對兩種酶解物中還原糖質(zhì)量分數(shù)進行分析（見圖5）。還原糖質(zhì)量分數(shù)都隨著溫度升高先增加后降低。55 ℃時，還原糖質(zhì)量分數(shù)達到最高，證明蛋白酶中確實存在少量淀粉酶，能夠酶解淀粉產(chǎn)生還原糖。堿性蛋白酶處理組還原糖質(zhì)量分數(shù)遠高于中性蛋白酶處理組。隨著溫度升高，淀粉酶活力逐漸提升[30]，淀粉被降解為小分子低聚糖，使還原糖質(zhì)量分數(shù)增加。離心使物料中的還原糖進入上清液，其還原糖質(zhì)量分數(shù)逐漸升高；高于55 ℃時，淀粉逐漸糊化，底物黏度升高，流動性差，沉淀物逐漸增多，上清液質(zhì)量減少，還原糖質(zhì)量分數(shù)也逐漸降低。

圖5 浸泡溫度對還原糖質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.5 Effect of the soaking temperature on the reducing sugar content

綜合以上結(jié)果，浸泡溫度選擇50 ℃為最佳。

2.3 浸泡時間對酶水解效果的影響

2.3.1 對蛋白肽純度的影響不同蛋白酶水解所得蛋白肽純度見圖6，隨著浸泡時間的延長，蛋白肽純度都先增加后減少，浸泡2.5 h 時，蛋白肽純度達到最高，中性蛋白酶水解得到蛋白肽純度為27%，堿性蛋白酶水解得到蛋白肽純度為25%。因此，浸泡時間2.5 h 較為合適。這可能是因為隨著浸泡時間的延長，蛋白酶水解效果逐漸增加，蛋白肽純度逐漸增加，當浸泡時間超過2.5 h，淀粉吸水膨脹，黏度增加，與蛋白質(zhì)難以分離，上清液中蛋白質(zhì)減少，蛋白肽純度逐漸下降。

圖6 浸泡時間對蛋白肽純度的影響Fig.6 Effect of soaking time on peptide purity

2.3.2 對蛋白肽得率的影響不同蛋白酶水解所得蛋白肽得率見圖7，隨著浸泡時間的延長，蛋白肽得率都先增加后減小。浸泡2.5 h 時，蛋白肽得率最高，堿性蛋白酶處理組達到85%，中性蛋白酶處理組為75%，因此，確定浸泡時間為2.5 h。隨著浸泡時間的延長，淀粉顆粒膨脹可能增加蛋白質(zhì)的分散度，使其更易被酶水解，超過2.5 h，淀粉顆粒體積過大且臨近糊化狀態(tài)，物料流動性變差，可能會阻隔蛋白質(zhì)與酶反應，因此，得率逐漸降低。堿性蛋白酶水解效果較中性蛋白酶佳。

圖7 浸泡時間對蛋白肽得率的影響Fig.7 Effect of soaking time on the peptide yield

2.3.3 對蛋白肽水解度的影響不同蛋白酶作用后，蛋白肽水解度見圖8，隨著時間增加，水解度都逐漸降低。這是因為隨著浸泡時間的延長，淀粉顆粒膨脹，體積變大，糊化度升高，臨近糊化狀態(tài)，流動性變差，可能會阻隔蛋白質(zhì)與酶反應，時間越久，黏度越大，可被水解的蛋白質(zhì)包裹其中，難以分離，同時酶活力也逐漸下降，因此水解度逐漸降低，但相同條件下，堿性蛋白酶水解效果較中性蛋白酶佳。

圖8 浸泡時間對蛋白肽水解度的影響Fig.8 Effect of soaking time on peptide hydrolysis degree

綜上可知，以小麥蛋白肽純度和得率為主要評價指標，選擇時間為2.5 h 最佳。

2.3.4 對還原糖質(zhì)量分數(shù)的影響對兩種酶解物中的還原糖進行分析，結(jié)果見圖9，還原糖質(zhì)量分數(shù)都隨著浸泡時間的增加逐漸降低，這可能是因為浸泡時間越久，淀粉顆粒越膨脹，結(jié)合水分的含量越高，因此離心得到的上清液質(zhì)量越少，其還原糖質(zhì)量分數(shù)越低。堿性蛋白酶水解得到的還原糖質(zhì)量分數(shù)較中性蛋白酶高，證明堿性蛋白酶中淀粉酶較多。

圖9 浸泡時間對還原糖質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.9 Effect of soaking time on the reducing sugar content

2.4 驗證實驗

以不加酶組為空白對照組，測得蛋白肽純度為5.5%，得率為17.1%，水解度為2.4%，還原糖質(zhì)量分數(shù)為5.1%，進一步驗證蛋白酶中含有少量淀粉酶可以產(chǎn)生還原糖，堿性蛋白酶中淀粉酶含量高于中性蛋白酶。

3 結(jié) 語

通過對不同預處理和不同酶制備蛋白肽效果的影響進行研究，得到以下結(jié)論：1）浸泡預處理工藝采取浸泡后加酶水解效果更佳。2）通過對酶解物中還原糖質(zhì)量分數(shù)進行分析，結(jié)果表明堿性蛋白酶中淀粉酶含量較高，會產(chǎn)生相對多的淀粉糖。此現(xiàn)象尚未在工業(yè)生產(chǎn)中引起重視，為了提高蛋白肽純度和得率，也需要進一步探究和觀察。3）最佳浸泡條件為浸泡溫度50 ℃，浸泡時間2.5 h。此條件下，中性蛋白酶水解得到蛋白肽純度為27%，得率為75%，水解度為17.6%，還原糖質(zhì)量分數(shù)為5.9%；堿性蛋白酶水解得到蛋白肽純度為25%，得率為85%，水解度為23.7%，還原糖質(zhì)量分數(shù)為9%。

通過單因素實驗對各項指標進行評價，探討了非糊化工藝及條件對小麥蛋白肽酶法生產(chǎn)的影響及機理，要想獲得更科學的實驗結(jié)果，還需要通過響應面優(yōu)化實驗進一步探究。另外，蛋白肽的純度整體較低，主要是酶解時間有限，在后續(xù)研究中將對酶解條件做進一步探究。