啶蟲脒分子印跡熒光傳感器的構建及檢測研究

毛家洛，韓奕奕，王 震，王勝潔，魏子奇，曹 慧，袁 敏，葉 泰，徐 斐*

（1.上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093；2.上海市農產品質量安全中心，上海 201708；3.上海皓信生物科技有限公司，上海 201100）

啶蟲脒（acetamiprid）是一種新煙堿類殺蟲劑，由于其具有高效、低毒、殺蟲譜廣、用量低、內吸傳導性好、與常規農藥無交互抗性等化學及生物特性，已被用來替代有機磷、有機氯等常規高毒農藥用于果蔬等農產品中。啶蟲脒通過食物鏈在體內長期累積，可能對身體造成極大的危害[1]，因此我國出臺了相關標準對蔬菜中的啶蟲脒殘留進行限量規定。根據國家食品安全標準（GB2763—2021）：啶蟲脒在冬瓜、大白菜以及番茄等果蔬中的殘留限量為0.2～1.0 mg/kg。因此亟待開發高靈敏度的啶蟲脒農藥殘留檢測技術[2]。

分子印跡聚合物具有高度的選擇性，不僅可以從復雜食品基質中特異性的富集痕量目標物，還具有耐高溫高壓、耐酸堿、不易被破壞且能重復使用等優良特性，因而已被廣泛應用于待測樣品中目標物的選擇性富集和檢測[3]。Boontongto 等使用磁性雙模板印跡聚合物對果蔬中的有機磷農藥進行富集，回收率為81.3%～110.6%[4]；Immaferrer 等以特丁嗪為模板合成了一系列分子印跡聚合物，這些聚合物對6 種氯三嗪農藥的回收率達到80%，進一步結合LC-DAD 技術，能夠對環境樣品中的農藥殘留進行高效檢測[5]；Zhao 等結合分子印跡技術和高效液相色譜串聯質譜法測定了黃瓜樣品中的20 種三唑類農藥，檢出限小于0.4 μg/L，可用于農產品中三唑類農藥的定量分析[6]。這些方法雖然具有較高的靈敏度，但需要配備氣相色譜、高效液相色譜以及氣/液相色譜-質譜聯用（GC/LC-MS）[4]等大型分析儀器，存在儀器設備昂貴、操作復雜及對樣品前處理要求高等不足。

鑭系金屬有機框架（LMOF）[7]、量子點[8]、發光染料[9]等熒光材料已被作為信號探針包埋于印跡聚合物基質中，以實現對復雜食品樣品中痕量目標物的定量速測。在這些標記物中，量子點熒光探針因具有高效的發光性能、可協調的激發光譜、高度的靈敏性以及優秀的抗光漂白特性，已受到廣泛關注[10]。程序森等將碳量子點包埋于制備的分子印跡聚合物中，并應用于蜂蜜中甲硝唑的檢測，在最優條件下，檢出限低至7.2 nmol/L，樣品的加標回收率為92.3%～95.1%[11]；趙曉磊等使用碳量子點制備的分子印跡材料對多巴胺展現出了高靈敏的響應，該方法的線性范圍為0.02～0.30 mg/L，檢出限為0.01 mg/L，實際樣品的加標回收率為76.7%～118.4%，且可應用于復雜樣品中多巴胺的定量分析[12]。基于此，以啶蟲脒為模板分子，并結合分子印跡聚合材料的專一性、構效預定性和廣泛適用性，以及改性硅碳量子點的高度靈敏性，采用改進的溶膠-凝膠策略制備了啶蟲脒分子印跡熒光傳感器，同時對該傳感器的檢測性能及機理進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司產品；RF-6000 熒光分光光度計：日本島津儀器公司產品；特氟龍高壓反應釜：鄭州博科儀器設備有限公司產品；K-Alpha X 射線光電子能譜儀、FEI Inspect F50 掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡：美國賽默飛世爾科技有限公司產品；PerkinElmer 傅里葉紅外變換光譜儀：珀金埃爾默儀器有限公司產品；FLS1000 熒光壽命測定儀：英國愛丁堡儀器公司產品。

啶蟲脒、吡蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺（均為標準樣品）：上海市農藥研究所提供；二苯基二乙氧基硅烷（DPDS） 、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES） 、硅酸四乙酯（TEOS）、環己烷、正己醇、曲拉通、無水乙醇（均為分析純）：阿拉丁化學試劑有限公司產品；氨水、檸檬酸三鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 啶蟲脒分子印跡熒光傳感器的制備及表征

1.2.1 硅碳量子點（SiCDs）的合成將0.4 g 檸檬酸三鈉置于兩頸燒瓶中，加入8 mL 去離子水溶解，脫氣15 min；向上述溶液中加入2.0 mL APTES，攪拌10 min 后轉移至50 mL 特氟龍高壓反應釜中，并在200 ℃下反應2 h；反應完畢后將反應溶液冷卻至室溫，再用透析袋（截留相對分子質量1 000）透析24 h，得到藍色的硅碳量子點；收集量子點，并置于4 ℃冰箱下保存。

1.2.2 啶蟲脒分子印跡熒光傳感器（SiCDs@MIPs）的制備二氧化硅納米微球的合成[13]：在磁力攪拌下將5 mL Triton X-100、20 mL 環己烷和5 mL 正己醇混合，劇烈攪拌15 min；接下來依次將50 μL TEOS 和135 μL NH3·H2O（體積分數25%～28%）添加到上述混合液中，攪拌8 h；向反應體系加入20 mL 丙酮破乳，用無水乙醇和超純水洗滌幾次后，避光置于60 ℃真空干燥箱內干燥，備用。

SiCDs@MIPs 的制備[14]：將30 mg 二氧化硅納米微球分散于20 mL 無水乙醇和7.5 mL 水中，再加入13 mg 啶蟲脒、27 μL APTES 和31 μL DPDS，攪拌20 min 后，依次加入1 mL 0.2 mol/L CTAB 溶液、50 μL TEOS、100 μL 0.2 mol/L NaOH 溶液和SiCDs，并在室溫黑暗下磁力攪拌12 h；反應完畢后采用乙腈和乙醇混合液（體積比2∶8）洗脫模板，直至無啶蟲脒紫外吸收峰出現，然后將獲得的SiCDs@MIPs在60 ℃下烘干，備用。SiCDs@NIPs 的制備過程與SiCDs@MIPs 一致，只是不加入啶蟲脒模板。制備原理見圖1。

圖1 基于SiCDs 的分子印跡熒光傳感器制備原理圖Fig.1 Schematic diagram of preparation of molecularly imprinted fluorescence sensor based on SiCDs

1.2.3 SiCDs@MIPs 的表征采用TEM 透射電鏡、X 射線光電子譜（XPS）、SEM 掃描電子顯微鏡及傅里葉紅外光譜對制備的SiCDs@MIPs 表面形態及結構進行表征。

1.3 SiCDs@MIPs 對啶蟲脒的檢測過程及檢測性能評價

1.3.1 檢測過程將10.0 mg SiCDs@MIPs 分散于30 mL 超純水中，超聲處理5 min；取600 μL 超聲分散后的SiCDs@MIPs 與300 μL 啶蟲脒農藥進行混合，漩渦振蕩反應20 min；反應完畢后在345 nm激發波長下記錄反應溶液在437 nm 處的相對熒光強度。猝滅率（C）的計算公式為C=（F0-F）/F0×100%，其中F和F0分別代表加入和不加入啶蟲脒農藥時SiCDs@MIPs 的相對熒光強度。

1.3.2 熒光穩定性評價將10 mg SiCDs@MIPs 超聲分散于30 mL 超純水中，并在437 nm 處每隔10 min 測定一次加入與不加入啶蟲脒農藥（1.0 μg/mL）時SiCDs@MIPs 的相對熒光強度，實驗結果以F0/F表示。

1.3.3 選擇性與特異性評價將 10 mg SiCDs@MIPs 或SiCDs@NIPs 超聲分散于30 mL 超純水中，分別取600 μL 的1 μg/mL 啶蟲脒、吡蟲啉、噻蟲胺和噻蟲嗪進行反應，以考察SiCDs@MIPs的選擇性和特異性。

1.4 樣品處理

將5.00 g 攪碎后的蔬菜樣品置于50 mL 離心管中，加標靜置30 min，再加入6 mL 乙腈（含體積分數1%的乙酸）進行振蕩提取3 min；在離心管中加入5.00 g MgSO4和0.50 g NaCl 固體，渦旋振蕩120 s 后，加入300 mg GCB、300 mg PSA 和300 mg C18，并劇烈振蕩3 min；取上清液加入600 μL 氯仿進行液液微萃取，并將下層有機相置于玻璃試管中，于80 ℃水浴中蒸干，再用200 μL 水復溶；在處理好的樣液中加入SiCDs@MIPs，并按照1.3 中的步驟進行熒光測定。

2 結果與討論

2.1 SiCDs@MIPs 的表征

采用X 射線光電子譜對SiCDs@MIPs 進行表征。圖2中清晰地顯示了N1s（399 eV）、C1s（285 eV）、O1s（532 eV）和Si2p（103 eV）的信號峰，表明模板分子和功能單體APTES 在交聯劑TEOS 的作用下發生了溶膠-凝膠反應，并形成了二氧化硅印跡層。在1 080 eV 和165 eV 處出現的Na1s 和S2p 的信號峰則證明了SiCDs 已經被成功包裹到印跡聚合物中。

圖2 SiCDs@MIPs 的XPS 圖Fig.2 XPS spectra of SiCDs@MIPs

采用傅里葉紅外光譜對SiCDs@MIPs 的結構進行表征。由圖3可見，在794.78、3 186.82 cm-1和1 561.22 cm-1處出現的峰分別歸因于Si—O 的伸縮振動、N—H 的伸縮振動和Si—O—Si 的不對稱拉伸振動，表明啶蟲脒分子印跡熒光探針已被成功合成。

圖3 SiCDs@MIPs 的FT-IR 圖Fig.3 FT-IR spectra of SiCDs@MIPs

采用掃描電子顯微鏡和透射電鏡對SiCDs@MIPs 的形貌結構進行表征。由圖4（a）可見，合成的SiCDs@MIPs 微球大小均一且外表面較粗糙。由圖4（b）可見，SiCDs@MIPs 呈現出典型的核殼結構，中間的黑色部分為二氧化硅納米核，外殼的淺色部分為印跡層。結果均表明，SiCDs@MIPs 微球已經被成功合成。

圖4 SiCDs@MIPs 的形貌結構Fig.4 Morphological structure of SiCDs@MIPs

2.2 SiCDs@MIPs 制備條件的優化

2.2.1 模板與功能單體的物質的量比優化為了提高聚合物的識別性能，采用APTES 和DPDS 作為雙功能單體，并考察了模板與功能單體物質的量比對SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響。由圖5可見，隨著功能單體與模板物質的量比的增加，F0/F呈先增加后減小的趨勢，這是因為當功能單體的添加量不足時，導致分子印跡聚合物中形成較少的空穴位點，進而降低了檢測的靈敏性。當啶蟲脒與功能單體的物質的量比為1∶4 時，F0/F達到最高，為1.33。隨著功能單體添加量的進一步增加，F0/F反而下降，這可能是因為過量的功能單體導致自身發生交聯，使得傳質困難[15]。因此，啶蟲脒與功能單體的最適物質的量比選擇為1∶4。

圖5 模板與功能單體物質的量比對SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響Fig.5 Effect of the ratio of template to functional monomers on the fluorescence quenching of SiCDs@MIPs

2.2.2 交聯劑添加量的優化進一步考察了交聯劑TEOS 的添加量（25、50、100、150 μL）對SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響。由圖6可知，當TEOS 的添加量為25 μL 時，F0/F達到最大，為1.43。當TEOS 的添加量小于25 μL 時難以形成印跡層，而過量的TEOS 則可能導致過厚的印跡層，使啶蟲脒不易接觸到包裹在印跡層內部的量子點，進而影響檢測的靈敏度[16]。因而，TEOS 的最優加入量確定為25 μL。

圖6 TEOS 添加量對SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響Fig.6 Effect of the amount of TEOS on the fluorescence quenching of SiCDs@MIPs

2.2.3 SiCDs 包埋量的優化SiCDs 在SiCDs@MIPs中的包埋量也會影響檢測的靈敏度，因而，考察了SiCDs 的包埋量對SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響。由圖7可知，當SiCDs 的包埋量為10 mg/kg 時，F0/F最大。隨著SiCDs 包埋量的增加，F0/F顯著降低。這是因為當SiCDs 在SiCDs@MIPs 中的包埋量較高時，需要將SiCDs@MIPs 稀釋至合適的熒光值才能進行檢測，稀釋后的SiCDs@MIPs 對啶蟲脒的吸附量也降低，因而影響了檢測的靈敏度。

圖7 SiCDs 包埋量對SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響Fig.7 Effect of the embedding amount of SiCDs on the fluorescence quenching of SiCDs@MIPs

2.3 SiCDs@MIPs 對啶蟲脒農藥檢測性能的評價

在最優條件下，對SiCDs@MIPs 的檢測性能進行了研究。由圖8（a）可知，在0～4.5 μmol/L 時，隨著啶蟲脒農藥濃度的逐漸增加，SiCDs@MIPs 的相對熒光強度逐漸降低。進一步以F0/F為縱坐標，啶蟲脒濃度為橫坐標繪制熒光猝滅曲線圖（見圖8（b））。如圖8（c）所示，范圍為0.045～0.450 μmol/L 時，F0/F與啶蟲脒濃度呈線性關系y=0.445 6x+1.109 5 （r2=0.989），檢出限根據3Sb與K比值（Sb是空白標準偏差，K是校準曲線的斜率）計算為0.086 μmol/L。

圖8 SiCDs@MIPs 對不同濃度啶蟲脒響應的熒光圖譜和猝滅線性曲線圖Fig.8 Fluorescence spectra and fluorescence quenching linear curve of SiCDs@MIPs in response to acetamiprid at different concentrations

進一步將啶蟲脒農藥加入SiCDs@MIPs 中，每隔10 min 測定一次其在437 nm 處的相對熒光強度，以評價其檢測穩定性。由圖9（a）所示，在120 min 內F0/F較為穩定，表明SiCDs@MIPs 具有良好的檢測穩定性。進一步選取啶蟲脒的結構類似物噻蟲嗪、吡蟲啉和噻蟲胺來驗證所建立方法的特異性。由圖9（b）可知，啶蟲脒對SiCDs@MIPs 的猝滅響應最強，這是因為啶蟲脒可以通過氫鍵特異性結合到SiCDs@MIPs 的印跡空腔中，進而通過光致電子轉移導致其部分熒光猝滅。噻蟲嗪、噻蟲胺與啶蟲脒具有相似的分子結構，因而也有一小部分通過氫鍵吸附到SiCDs@MIPs 中，造成其MIPs 和NIPs 之間的響應差異，但這些結構類似物對SiCDs@MIPs 的猝滅響應均較弱。Yu 等研究也發現，由于結構的高度相似，噻蟲嗪和噻蟲胺對啶蟲脒的印跡聚合物會表現出一定的響應效果[17]。

圖9 SiCDs@MIPs 的熒光穩定性以及選擇特異性Fig.9 Fluorescence stability and selective specificity of SiCDs@MIPs

2.4 啶蟲脒農藥對SiCDs@MIPs 的猝滅機理研究

為了探究啶蟲脒農藥對SiCDs@MIPs 的猝滅機理，首先采用紫外分光光度計測定了啶蟲脒的紫外吸收峰，結果見圖10。其出峰位置在245 nm 左右，這與SiCDs@MIPs 的熒光激發峰和發射峰都不重疊，因此可以排除熒光共振能量轉移和內濾作用[18-19]。進一步以時間為橫坐標，相對熒光強度為縱坐標繪制SiCDs@MIPs 的熒光衰減曲線圖。由圖11可知，SiCDs 的熒光壽命為5.335 ns，當加入啶蟲脒后，SiCDs 的熒光壽命降至4.972 ns，表明啶蟲脒農藥使SiCDs 發生了動態電子轉移，進而導致其熒光猝滅。

圖10 啶蟲脒的紫外吸收和SiCDs 的熒光發射圖Fig.10 Ultraviolet absorbance spectrum of acetamiprid and fluorescent emission diagram of SiCDs

圖11 SiCDs 的熒光衰減曲線Fig.11 Fluorescence decay curve of SiCDs

2.5 實際樣品檢測

將制備的SiCDs@MIPs 應用于白菜、冬瓜和番茄中啶蟲脒的檢測，以驗證其在實際樣品中應用的可行性。由表1可知，SiCDs@MIPs 對不同加標樣品中啶蟲脒的回收率為73.0%～109.0%，相對標準偏差（n=3）為1.21%～7.49%，表明SiCDs@MIPs 可應用于蔬菜中啶蟲脒農藥的測定。

表1 SiCDs@MIPs 對蔬菜樣品中啶蟲脒的加標回收驗證（n=3）Table 1 Standard recovery of acetamiprid in the vegetable samples by SiCDs@MIPs（n=3）

3 結 語

結合熒光量子點技術和分子印跡技術，采用改進的溶膠-凝膠策略制備了可應用于實際樣品中啶蟲脒檢測的分子印跡熒光傳感器SiCDs@MIPs。SiCDs@MIPs 表現出典型的核殼結構，較薄的印跡層可加速模板分子在其中的傳質效率。在最優檢測條件下，SiCDs@MIPs 對啶蟲脒的檢出限為0.086 μmol/L，線性范圍為0.045～0.450 μmol/L，相關系數為0.989，檢測時間僅需25 min，回收率可達到73.0%～109.0%，能夠滿足對蔬菜中啶蟲脒農藥殘留檢測的要求。