食用菌發酵液對銅綠假單胞菌生長和生物膜形成的影響

陳 敏 梁馨云 文秋嘉 張 薇 郭文濤

抗生素的使用能夠有效降低感染性疾病的致死率，然而長期使用抗生素會對病原菌形成選擇壓力，產生抗性突變，導致病原菌耐藥性的產生和蔓延。耐藥菌的存在限制了抗生素的使用，因此尋找新的抗菌藥物迫在眉睫[1]。群體感應是細菌通過感知周圍環境中的信號分子調控相關基因表達，調節自身以及周圍細菌的生長，菌體間相互感應、交流，從而適應環境變化[2-3]。群體感應系統能夠對生物膜的形成、毒力因子的表達等進行調控，由于群體感應不會直接影響微生物的生長，可避免產生生存壓力與誘導耐藥性，因此群體感應可以作為新型抗微生物藥物的靶標[4]。

銅綠假單胞菌是常見致病菌，臨床上常發現銅綠假單胞菌的耐藥菌，給臨床治療造成很大困難[5-6]。食用菌多糖能夠抑制細菌的生長，前期的研究發現香菇和雞腿菇發酵液在一定程度上可以抑制白色念珠菌生物膜的形成[7]，本研究通過制備食用菌的液態發酵液，分析其對銅綠假單胞菌生長和生物膜形成的影響，為篩選新型抗感染藥物尋找新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 食用菌和指示菌株供試食用菌香菇、茶樹菇、金針菇、杏鮑菇、雞腿菇、木耳為本實驗室保存。銅綠假單胞菌PAO1 和紫色桿菌CV026 均為實驗室保藏。

1.1.2 培養基食用菌液體發酵培養基：玉米粉20 g，麩皮40 g，蔗糖30 g，溶于1 000 ml 蒸餾水中，調pH 值為7.0。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）、沙氏瓊脂（Sabouraud's agar, SDA）培養基、LB 培養基購于杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備YC-1102D 大容量恒溫振蕩器：上海程造儀器設備有限公司；LHP150L/250L 恒溫恒濕培養箱：常州冠軍儀器制造有限公司；生物安全柜：蘇州長留凈化科技有限公司；Multiskan SkyHigh全波長酶標儀：美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 食用菌液體發酵液的制備食用菌菌種接種于PDA 斜面，28 ℃培養6 d 得到斜面菌種，將菌種接種到100 ml 液體培養基中28 ℃，180 轉/min 搖床培養 5 d 得到液體種子。按照7%的比例接種液體種子到100 ml 液體培養基中，28 ℃，180 轉/min 搖床培養10 d，得到液體發酵液。

1.2.2 群體感應抑制劑的篩選報告菌株CV026 活化后轉接到液體培養基，按體積分數1%接種到10 ml含有20 μg/ml 卡那霉素的LB 培養基，150 轉/min，30 ℃ 培養16 h，取1 ml 菌液與含有20 μg/ml C6-HSL LB 半固體培養基混勻，倒平板。用打孔器打孔，將食用菌發酵液分別注入到小孔中，放置在28 ℃下恒溫培養18 h，觀察紫色素產生情況，判斷食用菌發酵液是否具有群體感應抑制作用。

1.2.3 銅綠假單胞菌的培養配制2×LB 液體培養基，取1 ml 加入試管中，加入1 ml 食用菌發酵液，對照組設置為加蒸餾水，充分混勻。加入10 μl 吸光度A600 nm值為0.5的銅綠假單胞菌液，30 ℃，150轉/min恒溫振蕩培養過夜。置于離心管中4 500 轉/min 離心10 min，取上清液置于4 ℃保存備用。

1.2.4 食用菌液體發酵液對綠膿菌素產生量的影響取上清液2 ml，與1.5 ml 氯仿震蕩混合，置于離心機中4 500 轉/min 離心10 min，將氯仿提取液轉移到新的離心管中，加入1.5 ml 2 mol/L HCl，充分混勻后靜置片刻，取上層鹽酸相中的液體，分光光度計檢測在520 nm 處的吸光值，實驗3 次取平均值。

1.2.5 牛奶平板法分析胞外蛋白酶活性量取2 g脫脂奶粉溶解到50 ml 蒸餾水中，同時稱1.5 g 瓊脂溶解到50 ml 蒸餾水中。兩液分別高壓滅菌后冷卻至45～50 ℃，混合均勻后倒平板。使用0.6 cm的無菌打孔器在平板上打孔，取50 μl 上清液加入孔中，第2 天測量透明圈大小，比較不同組別水解圈的直徑。

1.2.6 結晶紫染色法分析生物膜形成用去離子水輕輕地沖洗試管壁上的浮游菌。加入福爾馬林固定5 min，倒出后加入0.1%的結晶紫染色30 min，倒出染液加入去離子水輕輕洗滌3 次。45 ℃烘箱干燥后，加入95%乙醇洗脫附著在生物膜上的染料，分光光度計檢測有色溶液在650 nm 處的吸光值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，單因素方差分析比較不同組別間的差異，t檢驗用于兩組間比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 群體感應抑制劑篩選

在瓊脂平板上，香菇和雞腿菇發酵液加樣孔周圍的紫色素含量下降，出現渾濁、不透明的抑菌圈；而茶樹菇、金針菇、杏鮑菇、木耳發酵液孔周圍紫色素變化不大，菌株能正常生長。

2.2 食用菌發酵液對綠膿菌素產生量的影響

檢測發現香菇和雞腿菇發酵液A520 值分別為（0.276±0.022）和（0.319±0.035），與對照組（0.477±0.041）相比顯著降低（P＜0.05）。

2.3 食用菌發酵液對胞外蛋白酶活性的影響

細菌產生的蛋白酶能夠分解平板中脫脂牛奶形成的透明圈，檢測發現加入香菇和雞腿菇發酵液后，透明圈的直徑分別為（1.4±0.1）cm 和（1.3±0.2）cm，與對照組（2.1±0.2）cm 相比顯著降低（P＜0.05）。

2.4 食用菌發酵液對生物膜形成的影響

經過培養后，能夠在試管表面形成一層薄膜，且不會被無菌0.9%氯化鈉注射液沖洗掉，香菇和雞腿菇發酵液均可在一定程度上抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，A650 值分別為（0.278±0.022）和（0.316±0.032），與對照組（0.475±0.044）相比顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

群體感應系統的存在提高了細菌的種群適應性，為細菌的耐藥性研究提供了新的角度。針對群體感應系統尋找群體感應抑制劑已成為抗菌藥物研究和耐藥性研究熱點領域[8-9]。食用菌作為天然可食用的大型真菌，研究發現提取物和發酵液除了具有藥用價值外，還具有一定的抑菌能力。食用菌中的多糖成分能夠對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等多種微生物產生抑制作用[10-11]。羅青等[12]的研究發現靈芝和猴頭菌絲體發酵液能夠對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌產生抑制作用，其中猴頭的抑菌效果更優。董蕾等[13]的研究發現杏鮑菇和蛹蟲草的發酵液、菌糠提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制效果。本研究采用紫色桿菌CV026 為研究菌株，對不同食用菌發酵液進行篩選，發現香菇和雞腿菇發酵液加樣孔周圍紫色素含量降低，這兩種食用菌可顯著抑制紫色桿菌CV026 紫色素的產生，具有作為群體感應抑制劑的潛能。

銅綠假單胞菌作為感染的常見致病菌，近年來在臨床中發現其耐藥性越來越嚴重。該菌的致病性受到群體感應系統的調控，群體感應系統能夠對綠膿菌素、胞外蛋白酶、生物膜等細菌生物學特征產生影響，增強了細菌的致病性[14]。生物膜是細菌分泌多種產物組成的復合物，依附于細菌表面。有生物膜的細菌環境適應能力提高，增加了在附著面的黏附能力，抑制部分藥物進入細菌體內，提高了細菌的耐藥性，逃避宿主的免疫防護[15]。本研究通過檢測香菇和雞腿菇發酵液對銅綠假單胞菌綠膿菌素、胞外蛋白酶、生物膜的影響，發現這兩種發酵液可以抑制綠膿菌素、胞外蛋白酶和生物膜的的產生。

食用菌發酵液純天然無公害，對人體的安全性較高，其抑菌作用的深入研究將有可能在食品和醫療上得到應用。本研究發現香菇、雞腿菇發酵液在控制銅綠假單胞菌感染中具有進一步的研究價值。通過對其作用成分的深入研究，將具有開發利用的巨大潛力。