菊花ANS基因的鑒定及與其他藥用植物的生物信息學分析

李東潤，劉 奧，許清烽，張宇婷

(遼寧何氏醫學院，沈陽 110000)

菊花在我國有悠久的用藥歷史，是藥食同源的中藥，來源于菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)的干燥頭狀花序，具有平肝明目、清熱解毒等功效，常用于治療風熱感冒、眼目昏花、目赤腫痛等癥狀[1-2]。菊花品種繁多，成分復雜，化學成分受到生長環境、產地、種質資源、采收期等因素的影響。

花青素(anthocyanins)是植物次生代謝中產生的黃酮類化合物，可使果實和花等產生特定的顏色。其中，花青素合成酶(ANS)位于花青素合成途徑的下游區段，是催化無色花色素轉變成為有色花色素的關鍵酶之一[3]。研究表明，花青素具有抗菌消炎、抗氧化、抗衰老等作用[4]。

利用生物信息學方法，對菊花ANS的理化性質、亞細胞定位、信號肽、蛋白質空間結構等進行分析，為菊花ANS基因的功能研究奠定基礎。對擬南芥(Arabidopsisthaliana)、紅花(Carthamustinctorius)、辛夷(Magnoliasprengeri)、玫瑰(RosarugosaThunb)、白桑(Morusalbavar.multicaulis)、茶(Camelliasinensis)等不同藥用植物的LDOX/ANS基因的核苷酸及氨基酸序列的組成、生化特性、結構特點等進行推測和分析，構建系統進化樹，以期明確該酶的結構和功能。

1 材料與方法

1.1 材料

菊花花青素合成酶ANS序列來源于Genbank美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)。

1.2 方法

ORF Finder在線工具查找ANS基因序列，ExPASy ProtParam工具分析ANS蛋白的理化性質(https://web.expasy.org/protparam/)，使用ExPASy ProtScale工具分析ANS的親/疏水性，利用SignalP-5.0工具在線預測ANS的信號肽，確認其是否為跨膜蛋白。利用PSORT工具預測ANS蛋白的亞細胞定位。用Predict protein和SWISS-MODEL工具分析二級結構和三級結構。利用MEGA-X軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 ANS序列分析

在NCBI數據庫中下載ANS基因序列，下載基因全長為1 238 bp，經blastp匹配，含有1個完整的開放閱讀框序列，長度為1 062 bp，起始于第78 bp，終止于第1 139 bp，氨基酸為353個。

圖1 菊花BLAST匹配Fig.1 Chrysanthemum BLAST matching

2.2 ANS蛋白理化性質分析

ANS蛋白分子質量為 39.59 kD，分子式為 C1811H2855N477O535S11，理論等電點是5.73，脂肪系數為90.87，平均疏水性為-0.409，表明ANS蛋白是親水性蛋白。半衰期為30 h，不穩定指數為41.45，屬于穩定蛋白。ANS蛋白氨基酸組成中，亮氨酸含量最高，占總氨基酸數的10.1%；脯氨酸和色氨酸含量最低，占總氨基酸數的1.4%。其中，負電荷氨基酸殘基總數為(Asp + Glu)51個，正電荷氨基酸殘基總數為(Arg + Lys)42個。詳見表1。

表1 不同植物LDOX/ANS基因及對應氨基酸序列的組成成分及理化性質Tab.1 Composition and physicochemical properties of LDOX/ANS genes and corresponding amino acid sequences in different plants

2.3 ANS蛋白信號肽預測分析

采用SignalP 5.0 Server在線軟件，分析預測8種不同來源ANS的信號肽。結果顯示，所有ANS均不含信號肽，說明ANS屬于非分泌性蛋白。亞細胞定位應用Cell PLoc server在線工具，分析得到菊花和百合位于細胞質，其他位于葉綠體。上述所有蛋白均沒有跨膜結構域，信號肽預測結果與跨膜結構域分析結果一致。

圖2 菊花信號肽預測Fig.2 Chrysanthemum signal peptide prediction

2.4 ANS二級及三級結構分析

通過SOPMA分析工具，預測菊花ANS氨基酸序列的二級結構，結果詳見表2，其中，菊花ANS蛋白質二級結構的主要結構元件是ɑ-螺旋、無規則卷曲、β-折疊、延伸鏈。對擬南芥及其他物種的氨基酸序列的二級結構進行預測，結果相似，說明菊花ANS與實驗中的大多數植物ANS蛋白一樣，具有穩定的青花素合成酶結構，進一步推斷菊花ANS基因可能在青花素代謝途徑中具有重要的作用。利用SWISS-MODEL在線工具，對ANS的三級結構進行預測，發現其三級結構組成與二級結構一致。

表2 ANS蛋白的二級結構主要構成組件比例Tab.2 Main constitutes proportions of the secondary structure of ANS proteins

圖3 菊花二級結構分析Fig.3 Chrysanthemum secondary structural analysis

圖4 菊花開放閱讀框(ORF)分析Fig.4 Analysis of Chrysanthemum Open Reading Frame (ORF)

2.5 比對分析ANS核苷酸序列及構建系統進化樹

用MEGA-X軟件對擬南芥、菊花、紅花、辛夷、玫瑰、百合、白桑、茶、巖藻在實驗中選定的9種植物的核苷酸序列做物種核苷酸序列，進行多序列比對分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining Tree，NJ)、最大似然法(Maximum-Likelihood Tree，ML)、最小進化法(Minimum-Evolution，ME)，分別進行系統進化樹的構建。結果表明，3種系統進化分析方法所得的結果較一致，其中，菊科紅花和菊科菊花的3種統計結果高度一致，在進化上分支上，得到的結果都是分為一支，這一結果與傳統形態分類的歸屬一致，另外，采用NJ法和ML法顯示，在進化上與十字花科的擬南芥進化距離更近，估計該基因在作用機制上也更加接近。

圖5 不同物種ANS基因基于鄰接法的系統進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of ANS genes in different species based on neighbor-joining method

圖6 不同物種ANS基因基于ML系統進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of ANS genes in different species based on ML

圖7 不同物種ANS基因基于ME系統進化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of ANS genes in different species based on ME

3 結論與討論

ANS作為花青素合成后期的關鍵酶一直受到了廣泛關注[5]。在花青素生物合成中，ANS 基因發揮著重要的作用，主要通過2-酮戊二酸離子和Fe2+，將無色的花青素催化成顯色的花青素[6-9]。從生物信息學角度，以菊花為研究對象，對擬南芥、菊花、紅花、辛夷、玫瑰、百合、白桑、茶共計9種藥用植物的LDOX/ANS基因的核苷酸及氨基酸序列的組成、理化性質、信號肽、親疏水性、二級結構、三級結構和進化關系等進行預測和分析。研究結果顯示，菊花ANS基因全長1 238 bp，含有1個完整的開放閱讀框序列，氨基酸為353個。ANS蛋白分子質量為39.59 kD，屬于穩定蛋白，ANS屬于非分泌性蛋白，亞細胞定位位于細胞質，沒有跨膜結構域，與信號肽預測結果一致。對菊花ANS二級結構域三級結構的分析表明，菊花具有穩定的青花素合成酶結構，推斷在青花素代謝途徑中，菊花ANS基因保守，意味著代謝中具有重要的、不可替代的作用。通過3種系統進化分析方法得到的結果一致較高，其中菊科紅花和菊科菊花在3種統計中的結果高度一致，在進化分支上，得到的結果都是分為一支，這與形態學上的分類是一致的。結果顯示，菊花ANS基因及蛋白質理化性質、空間結構等多個方面與其他植物有較高的一致性，推測菊花ANS基因的重要性與其他植物生物學功能具有相同或相似的特點，后期如開展實驗可以進一步驗證。