淡竹葉碳量子點的微波法制備及在細胞成像中的應用探究

胡妙言，劉凱，高詩雨，孫天懿，史繼晨，徐長妍，2，3*，徐麗，2，3*

（1.南京林業大學材料科學與工程學院，江蘇 南京 210000；2.南京林業大學江蘇省林產品高效加工利用聯合創新中心，江蘇 南京 210000；3.南京林業大學綠色生物質燃料與化學品江蘇省重點實驗室，江蘇 南京 210000；4.2019年江蘇省研究生工作站：靖江國林木業有限公司（工作站編號：2019_099），江蘇 靖江 214500）

1 引 言

碳量子點（Carbon quantum dots，CQDs）是一種零維碳基納米材料，具有良好的生物相容性和優異的光致發光性能[1]，被廣泛應用于細胞成像[2]、藥物傳遞[3]、離子檢測[4]等領域。碳量子點的物理化學性質受碳源和制備方法的直接影響，如雜原子的引入，可以改善CQDs的性質[5]。生物質材料一般具有豐富的雜原子，可實現CQDs合成過程中的雜原子自摻雜，無需引入新的摻雜劑或者經過繁雜的鈍化過程即可實現雜原子誘導而形成新的表面態，從而提高CQDs的熒光量子產率和熒光強度[6-7]。此外，生物質碳源還具有環保、成本低、來源廣泛的優點，還可以一定程度上替代昂貴的化學試劑[8-9]。近年來，一些生物質碳源如葡萄籽[5]、西蘭花[6]和大蒜[10]等已被用于合成雜原子摻雜的CQDs，且憑借其生物相容性良好、細胞毒性較低、熒光穩定性良好而在細胞成像等領域體現出良好的應用潛力。

碳量子點的合成方法包括微波法[11]、水熱法[12]、激光銷蝕法[13]和電弧放電法[14]等。其中，微波法相對于其他CQDs制備方法，是一種應用廣泛、綠色、快速、高效的碳量子點制備方法，通過高頻率電磁波作用，在短時間內使碳量子點的碳源發生碳化、裂解從而達到快速制備碳量子點的目的[15]。但是，通過微波法制備的CQDs目前仍然存在粒徑分布不均勻、性能可控性較差等問題[16]，這主要是因為其制備工藝參數的選取不合理所致。現有有關微波法制備CQDs工藝參數優化的研究多采用正交試驗設計方法，雖然可以在一定程度上優化CQDs制備工藝，但不能用于系統分析各個因素對響應值的影響主次順序、各因素兩兩組合的交互作用、對指定工藝下制備的碳點進行性能預判[11,15-16]。因此，科學優化CQDs的微波法制備工藝對于提高微波法制備CQDs的效率、改善CQDs的結構和性能從而促進其應用具有重要意義。

淡竹葉（Lophatherum gracile）是一種藥食同源的多年生草本植物，廣泛分布于中國、日本、韓國等亞洲國家[17-19]，已被中國食品添加劑標準化委員會批準為功能性食品工業中的天然添加劑[20]。淡竹葉富含的類黃酮、多糖、酚酸等生物活性物質和礦質元素賦予其良好的藥理作用，為建立具有良好生物相容性的CQDs的活性功能基團提供了機會[21]。但現階段淡竹葉除部分莖葉得到入藥利用以外，均被丟棄浪費[22]。如何提高淡竹葉的功能化、高附加值的轉換利用是該產業面臨的一個難題。

響應曲面法（Response surface methodology，RSM）是一種所需要的試驗組數相對較少的統計學試驗方法，可以找出各因素水平的最佳組合，揭示試驗指標與各因子間的定量規律。此外，采用該方法還可以在多元線性回歸的基礎上主動收集數據，獲得具有較好擬合效果的回歸方程的同時建立復雜多維空間曲面，使得預測較接近實際情況[23]。

經預實驗發現淡竹葉的C、O、Si、N元素含量較高，是合成氮硅自摻雜碳量子點（N/Si-CQDs）的理想材料，而利用淡竹葉制備CQDs的相關研究還未見公開報道[24]。值得注意的是，生物相容性和地球豐富度俱佳的氮（N）和硅（Si）元素，近年來由于適宜的原子大小、化學價態以及化學惰性和低毒性的優點，在CQDs摻雜過程中，易于引入多種官能團，提供更多的活性位點，產生更多的表面缺陷，可以獲得較高的量子產率和熒光強度，因而在CQDs摻雜領域受到廣泛關注[4,7,12]。但現階段隨著雜原子的加入，引起了CQDs的粒徑增大，且由于摻雜CQDs的粒徑大小在細胞毒性與熒光特性方面起著重要的影響作用，CQDs的粒徑控制與尺寸均勻性不佳，在一定程度上限制了CQDs的實際使用。而近年來發展的極小CQDs（指粒徑小于3 nm的CQDs）由于平均粒徑較小、粒徑分布均勻，在生物醫學等諸多領域展現出更好的效果[9]。因此，本研究將淡竹葉作為唯一原料，以響應曲面法優化極小N/Si-CQDs的微波法制備工藝，并采用步驟簡單、應用廣泛的CCK-8實驗來評估N/Si-CQDs對轉染效率高、增長速度快、對外界微環境較為敏感的HEK293細胞的細胞毒性[25]，探索其在細胞成像中的應用潛力。

2 實 驗

2.1 實驗材料

實驗材料見表S1，所有試劑均為分析純，無需進一步純化即可使用。

2.2 N/Si-CQDs的微波法制備

2.2.1 實驗方案

采用微波法制備淡竹葉氮硅自摻雜碳量子點（N/Si-CQDs）的工藝參數優化包括兩步。首先，以N/Si-CQDs的熒光量子產率（QY）為評價指標，結合已有研究[1,16]，采用單因素實驗設計，初步確定微波作用時間（T，min）、微波功率（W，W）和淡竹葉與去離子水的料液比（R，mg/mL）的取值范圍，見表S2。其中，單因素實驗T的范圍為5～25 min，步長為5；W的范圍為200～1 000 W，步長為200；R的范圍為5～25 mg/mL，步長為5。然后，根據單因素試驗結果，以T、W和R為自變量，以QY為響應值，采用響應面法設計試驗方案，綜合考慮T、W和R對QY的協同作用，得到三個自變量的最優取值，并建立QY的預測模型。其中T的范圍為10～20 min，步長為5；W的范圍為400～800 W，步長為200；R的范圍為15～25 mg/mL，步長為5，見表1。

表1 響應面試驗因素水平編碼表Tab.1 Response surface test factor level coding table

2.2.2 實驗步驟

按照表S2中微波作用時間（T）、微波功率（W）和淡竹葉與去離子水的料液比（R）的取值，采用以下步驟制備N/Si-CQDs：第一步，使用250 mL的燒杯盛裝，選擇指定料液比的淡竹葉粉末與分散劑（去離子水10 mL）；第二步，利用磁力攪拌器（MYP11-2，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，中國）攪拌10 min，轉速為500 r/min，使淡竹葉粉充分分散在水中，并將燒杯放入微波爐（G90F23CN3LV-C2（S5）,Galanz,China）中進行微波處理；第三步，取出燒杯，加入30 mL去離子水攪拌，得到反應液，使用0.22μm濾微孔濾膜純化，以去除殘留物和大顆粒，并將過濾的反應液利用離心機（H-1650,Cence,China）以10 000 r/min轉速離心15 min，得到的上清液即為N/Si-CQDs水溶液；第四步，將上述N/Si-CQDs水溶液冷凍1 d后（-20℃），采用真空冷凍干燥機（Alpha 1-2 LDplus,BMH,China）在-60℃下干燥處理3 d，得到固體N/Si-CQDs，用于配制指定濃度的N/Si-CQDs水溶液及后續表征。所有試驗均重復3次。

2.3 N/Si-CQDs的性能表征

2.3.1 N/Si-CQDs的物理形貌表征

采用高倍率透射電子顯微鏡（JEM-2100 UHR,JEOL,Japan）表 征N/Si-CQDs的物理形貌。采用滴管將配制的N/Si-CQDs分散液（0.5 mg/mL）滴于超薄碳支撐膜上，自然晾干后，使用高倍率透射電子顯微鏡觀察N/Si-CQDs的形貌。

2.3.2 N/Si-CQDs的化學結構表征

采用拉曼光譜儀（HORIBA LabRAM.,HR Evolution,Fr）、傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS10,Thermo Electron Corp.,Madison,WI,USA）和X射線光電子能譜儀（AXIS Ultra ADLD,Shimadzu,Japan）表征N/Si-CQDs的化學結構。取N/Si-CQDs粉末（2 mg）與純KBr（200 mg）研細均勻，壓片（厚度1 mm，直徑13 nm），即可用于測定紅外光譜。取N/Si-CQDs粉末（0.1 g），壓片（厚度1 mm，直徑5 nm），即可用于測定XPS，結合能根據284.6 eV的C 1s峰校準。

2.3.3 N/Si-CQDs的光致發光特性表征

分別通過熒光分光光度計（LS55,Perkin-Elmer,USA）和紫外分光光度計（LAMBDA950,Perkin-Elmer,USA）在掃描速度均為300 nm/min的條件下，獲得配制的N/Si-CQDs水溶液（0.5 mg/mL）的熒光光譜和紫外-可見吸收光譜。本研究將獲得的熒光光譜峰值數據最大時所對應的激發波長定義為N/Si-CQDs的最佳激發波長。

根據公式（1）計算N/Si-CQDs的熒光量子產率QY（ηQY）[26]。選擇溶解在0.1 mol/L硫酸中的硫酸奎寧作為參比物（ηQY=54%），在激發波長360 nm處分別測定參比物和N/Si-CQDs水溶液樣品的熒光光譜和吸光度曲線。

其中，ηQY為N/Si-CQDs的熒光量子產率；I為測得的熒光光譜的積分面積，下標R代表參比物，X代表N/Si-CQDs樣品；A為360 nm激發波長處的吸光度；η為折射率，在本研究中，ηX/ηR=1。熒光量子產率是研究弛豫過程和光化學歷程的重要參數，它表示物質將吸收的光能轉化成熒光的性能。熒光量子產率也與物質的化學結構有關，在定量的光化學中，熒光量子產率是一個十分有用的參量[26]。

碳量子點的熒光穩定性直接關系到在生物成像領域的應用效果，因此，本研究還探討了N/Si-CQDs的熒光穩定性，主要考察了紫外光（365 nm）照射與氯化鈉濃度以及不同pH對N/Si-CQDs熒光強度的影響，即N/Si-CQDs的抗光漂白性試驗、抗鹽性試驗和N/Si-CQDs在不同pH條件下的穩定性實驗[27-28]。在N/Si-CQDs的抗光漂白性試驗中，先將配制的N/Si-CQDs水溶液（0.5 mg/mL）密封于透明離心管并放置在暗室中，使用紫外燈持續照射不同時間（0，1，2，3，4，5，6 h）后，再利用熒光分光光度計記錄N/Si-CQDs溶液在最佳激發波長處的熒光光譜數據；在N/Si-CQDs的抗鹽性實驗中，為考察N/Si-CQDs受共存分子和離子的干擾情況，在pH=7的條件下分別在配制的N/Si-CQDs水溶液（0.5 mg/mL）中加入不同克重的Na-Cl，使NaCl的濃度達到指定值（0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mol/mL），再記錄N/Si-CQDs在不同NaCl濃度下在最佳激發波長處的熒光光譜數據；在N/Si-CQDs在不同pH條件下的穩定性實驗中，為考察N/Si-CQDs的熒光強度受不同pH條件的干擾情況，本研究將熒光光譜數據中的峰值定義為N/Si-CQDs的熒光強度（FL）。

2.4 N/Si-CQDs的細胞毒性試驗與細胞成像試驗

培養基配制：先將胎牛血清在56℃下滅活0.5 h，然后配制10%胎牛血清血清和1%雙抗的培養基；胰蛋白酶配制：精確稱定0.25 g胰蛋白酶到100 mL容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解定容；細胞懸液配制：細胞株中加入上述配制培養基，置于培養箱中培養（37℃，5% CO2），每隔24 h換液，待細胞密度達到70%～90%。用胰蛋白酶將細胞消化為細胞懸液。

細胞毒性試驗：采用CCK-8試劑盒測定N/Si-CQDs對人胚胎腎細胞（HEK293）的毒性。先將預先制備好的HEK293細胞懸液按每孔100μL加入到96孔培養板，每孔細胞密度為1×105個；然后將培養板在細胞培養箱預培養（37℃，5% CO2）24 h，再從培養箱里取出。每孔加入10μL不同質量濃度（12.5，20，50，100，200μg/mL）的N/Si-CQDs溶液（以無菌去離子水配制）后，放回培養箱（37℃，5% CO2）持續孵育24 h。從培養箱里取出培養板，再向每孔加入10μL的CCK-8溶液，再次放回培養箱（37℃，5% CO2）孵育2 h。拿出培養板，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。按照公式（2）計算細胞存活率（Cell viability）：

其中，As為實驗孔吸光度（含有細胞、培養基、CCK-8溶液、N/Si-CQDs溶液），Ac為對照孔吸光度（含有細胞、培養基、CCK-8溶液、不含N/Si-CQDs溶液），Ab為空白孔吸光度（含培養基、CCK-8溶液、不含細胞、N/Si-CQDs溶液）。

細胞成像實驗：先將預先制備好的細胞懸液接種到含有培養基的6孔培養板中，再將培養板在培養箱預培養24 h（37℃，5% CO2），然后用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）緩沖液（pH=7.4）洗滌細胞。將濃度為200μg/mL的N/Si-CQDs溶液加入孔中，并進一步孵育24 h。然后，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（pH=7.4）洗滌三次，去除多余的沒有進入細胞的N/Si-CQDs，并使用共聚焦激光掃描顯微鏡（NIKON Eclipse Ti,NIKON,Japan）系統在405 nm激發波長下觀察細胞形態及熒光成像情況。

3 結果與討論

3.1 N/Si-CQDs的微波法制備工藝優化

3.1.1 單因素試驗

如圖1（a）～（c）所示，本研究通過控制單一變量分別得到了三因素（T、W、R）對熒光量子產率（QY）的影響。隨著微波時間自5 min增加至25 min，QY數值呈現出明顯的先增大后減小的變化趨勢，且在T=15 min時QY達到最高值1.34%（圖1（a））。當W由200 W增加至600 W時，QY由1.10%增至1.37%；但當W繼續從600 W增 至1 000 W時，QY反而由1.37%緩慢降低至1.36%（圖1（b））。此外，隨著R由5 mg/mL增至25 mg/mL，QY也呈現先增大后減小的變化趨勢，且在R=20 mg/mL時QY達到最高值1.54%（圖1（c））。綜上所述，在微波法合成N/Si-CQDs的過程中，需要經過“氧化分解-交聯-碳化”過程。為了使氧化分解發生，需要一定的溫度和反應時間閾值，這與微波功率及微波作用時間密切相關[15]。在單因素實驗中，我們發現，相對較低的功率和較短的反應時間可以觸發前驅體碳材料初步形成N/Si-CQDs碳核結構，具有相對較低的熒光；而功率的提升和反應時間的延長，往往使得前驅體進一步碳化，這造成了碳量子點材料表面官能團破壞與粒子聚集等，從而降低其熒光。綜合考慮三因素T、W、R對評價指標QY的影響，后續響應曲面優化設計選擇T的范圍為10～20 min，步長為5；W的范圍為400～800 W，步長為200；R的 范圍為15～25 mg/mL，步長為5。

圖1 單因素試驗結果分析：（a）T，（b）W，（c）R。Fig.1 Analysis of single factor test results：（a）T，（b）W，（c）R.

3.1.2 響應曲面法優化與驗證試驗

響應曲面法詳細優化實驗設計方案及結果見表S3，方差分析結果見表2。應用Design-expert統計軟件對響應面試驗數據進行二次多元回歸擬合得到：ηQY=1.61-0.1432*T+0.0348*W-0.0566*R+0.0125*TW-0.0270*TR+0.0187*WR-0.3018*T2-0.1281*W2-0.1336*R2。

由表2可知，本研究回歸模型（P＜0.001）顯著，失擬項（P=0.112 2＞0.05）[30]表明失擬項相對于絕對誤差不顯著。因此，該模型對試驗的擬合程度良好，能較好地反映各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該模型對實驗參數進行分析。由F與P值的大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內，3個因素對QY影響的順序為：T＞R＞W。二次項T2、W2和R2的影響極顯著，一次項T、R也達到極顯著水平，表明各提取工藝參數對量子產率的影響不是簡單線性關系[31]。根據回歸方程得到模擬的響應曲面圖及相應的等高線圖，如圖2（a）～（f）所示，響應面的坡度越大，等高線的形狀越接近橢圓形，說明響應面對該影響因素有較高的敏感度[32]，即對QY影響較大。

表2 回歸方程方差分析Tab.2 Variance analysis of regression equation

如圖2（a）～（f）所示，QY隨著三因素（T、W、R）的變化趨勢均呈現出一定弧度，但隨T因素變化，響應曲面變化更大，R因素次之，隨W因素響應曲面變化最小，說明T比R與W對量子產率具有更顯著的影響[23,32]，與方差分析結果一致。響應面分析得到最優工藝 為：T為14.056 min、W為618.52 W、R為19.8 mg/mL（10 mL去離子水），此時QY達到1.632%?？紤]到試驗的可行性與設備實際調節范圍，我們選擇T為14 min、W為600 W、R為19.8 mg/mL（10 mL去離子水），進行3次平行驗證試驗，其平均QY值為1.625%，與理論QY值（1.632%）相對偏差僅為0.215%，表明試驗數據與模型預測響應值的擬合性良好，證明該模型真實可信。因此，在后續的碳量子點結構和性能表征中，只選擇在上述最優工藝條件下制得的N/Si-CQDs為研究對象。

圖2 T與W（（a）～（b））、T與R（（c）～（d））、W與R（（e）～（f））對QY的影響。Fig.2（a），（b）Influence of T and W on QY.（c），（d）Influence of T and R on QY.（e），（f）Influence of W and R on QY.

3.2 N/Si-CQDs的結構與性能

3.2.1 N/Si-CQDs的物理形貌和化學結構

本研究采用高分辨率透射電子顯微鏡（TEM）研究了N/Si-CQDs的尺寸和形貌。如圖3所示，N/Si-CQDs均勻分布在水中，其顆粒多為球形，具有典型的非晶態碳質結構，無明顯晶格[33]。使用Nano measurer軟件隨機選取100個顆粒測量粒徑，得到N/Si-CQDs的平均粒徑為1.35 nm。與現有報道中采用微波法制備的生物質碳量子點相比，本研究制備的N/Si-CQDs粒徑更小、粒徑分布更窄，這更有利于其在細胞成像等領域的應用[34]。為進一步了解N/Si-CQDs分子結構研究，采用拉曼光譜法分析，如圖S1所示，在1 342 cm-1和1 588 cm-1處存在兩個主要峰值，分別是D-峰和G-峰[27]。D-峰和G-峰的強度比（I（D）/I（G））約為1.31，表明合成的N/Si-CQDs結構中存在大量的無定形碳，與上述TEM結果相互印證。

圖3 N/Si-CQDs的透射電鏡圖，插圖：N/Si-CQDs的粒徑分布圖。Fig.3 TEM image.Inset：particle size distribution of N/Si-CQDs

本研究借助紅外光譜和XPS光譜兩種表征手段，分析了前驅體淡竹葉與N/Si-CQDs所含元素、官能團和化學鍵，如圖S2、圖S3、圖4和圖5所示。在圖4中，3 270.39 cm-1處的寬峰對應于N—H鍵的拉伸振動或O—H伸縮振動，較寬峰的原因是：N、O的較強電負性導致其所對應的—NH2與—OH官能團可與溶H2O形成氫鍵[35]。在2 933.55 cm-1附近的峰表明N/Si-CQDs結構中存在C—H伸縮振動[36]；2 130.86 cm-1附近區域的峰表明N/Si-CQDs結構中存在炔烴的伸縮振動[37]；在1 574.09 cm-1的峰對應C=C鍵或N—H鍵的拉伸振動[35]；在1 361.12 cm-1處的吸收峰歸因于C—H鍵的彎曲振動[38]；在1 107.70 cm-1和1 041.83 cm-1處 的峰則應屬于Si—O和Si—N鍵伸縮振動[7]。與前驅體淡竹葉的的紅外光譜、XPS圖譜對比可知，經水相微波反應后，N/Si-CQDs相較于前驅體，親水性官能團含量提升，Si—O、Si—N等化學鍵大量生成，由此形成了N/Si-CQDs復雜表面態。

圖4 N/Si-CQDs的FT-IR光譜Fig.4 FT-IR spectrum of N/Si-CQDs

圖5 （a）N/Si-CQDs的XPS譜；（b）N/Si-CQDs的元素含量；（c）C 1s的高分辨率XPS譜；（d）N 1s的高分辨率XPS譜；（e）O 1s的高分辨率XPS譜；（f）Si 2p的高分辨率XPS譜。Fig.5 XPS of the N/Si-CQDs（a），element content（b），C 1s（c），N 1s（d），O 1s（e）and Si 2p（f）spectra of the N/Si-CQDs.

在圖5中，N/Si-CQDs的XPS全光譜顯示出4個主要的特征峰，分別對應于C 1s（284.8 eV）、N 1s（400.0 eV）、O 1s（532.2 eV）和Si 2p（102.2 eV）的結合能，這表明N/Si-CQDs含有C（72.1%）、N（1.1%）、O（23.7%）和Si（3.1%）4種元素。通過分峰擬合操作，得到C 1s、N 1s、O 1s和Si 2p的高分辨率XPS光譜（圖5（c）～（f））。其中，C 1s譜顯示出284.9，286.4，288.3 eV的3個峰，分別歸屬 于C—C[39]、C—O[40]和C=O鍵[41]。N 1s圖 中399.4 eV和400.2 eV處的峰分別歸因于N—Si[42]和N—H鍵[41]。在O 1s圖中，532.3 eV處有1個擬合峰歸屬于C—O鍵[39]；101.9 eV和102.7 eV的峰分 別 歸 屬 于Si—N[42]和Si—O鍵[43]?？?之，N/Si-CQDs的XPS譜圖分析表明，其結構中含有C—C、C—O、C=O、N—H、Si—N和Si—O鍵等，證實了N/Si-CQDs表面存在親水基團以及N/Si雜原子的成功摻雜，該結果與N/Si-CQDs的紅外光譜分析結果相互印證。

3.2.2 N/Si-CQDs的熒光性能及熒光穩定性

N/Si-CQDs的熒光發射呈現出激發波長依賴性，如圖6（a）。在370～430 nm激發波長條件下，N/Si-CQDs的熒光強度表現出先增高后降低的趨勢，且當最佳激發波長為400 nm時，在400 nm的激發波長下，如圖6（b）所示，N/Si-CQDs在492 nm處出現最大熒光發射峰，該發射波長位于綠光波段區域[44]。如上所述，最佳工藝制備的N/Si-CQDs表面富含多種官能團，這些官能團可以形成缺陷位點的捕獲中心[12]。一般來說，碳量子點的熒光機制與碳量子點表面態中電子和空穴之間的輻射復合有關[11]。即在一定激發波長條件下，本研究制備的N/Si-CQDs表面發生了電子與空穴的輻射復合，并被光捕獲。因此，制備的N/Si-CQDs的熒光行為受N/Si-CQDs表面狀態的支配。由目前對CQDs材料激發依賴性熒光機理探討的報道可知，表面多種官能團的存在會在其能隙之間形成多重能級及相應的多重電子躍遷，引起CQDs材料的激發依賴行為[12,15]。因此，本研究認為制備的N/Si-CQDs復雜的表面態導致了激發態的多樣性，即不同表面官能團的存在導致不同躍遷模式或引起多種不同能級，進而導致N/Si-CQDs的激發依賴現象。

為了進一步闡明N/Si-CQDs的光學性質，如圖6（b）所示，本研究對配制的N/Si-CQDs水溶液（0.5 mg/mL）進行了紫外-可見吸收光譜與熒光光譜分析，N/Si-CQDs樣品在260～350 nm的紫外波長范圍內表現出吸收，這通常歸屬于C=C鍵的π-π*躍遷，表明了N/Si-CQDs中共軛結構的形成[45]。此外，由圖6（b）中的插圖可見，N/Si-CQDs水溶液在可見光下呈淺黃色，在365 nm紫外光下表現藍色熒光。N/Si-CQDs具有的良好光致發光特性可能是由于芳香族sp2結構域的帶隙躍遷、N/Si-CQDs的量子尺寸效應和表面缺陷所致[46]。

圖6 （a）不同激發波長下N/Si-CQDs的發射光譜；（b）N/Si-CQDs的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜，插圖：N/Si-CQDs水溶液分別在可見光（左）和紫外光365 nm（右）下的照片。Fig.6（a）Emission spectra of N/Si-CQDs at different excitation wavelengths.（b）UV-Vis absorption spectra and fluorescence spectra of N/Si-CQDs.Inset：photograph of N/Si-CQDs aqueous solution under visible light（left）and ultraviolet light（365 nm，right）.

圖7為N/Si-CQDs的熒光強度（FL）IFL穩定性試驗結果。圖7（a）的橫坐標表示波長為365 nm的紫外光照射時長（0，1，2，3，4，5，6 h），本研究將“紫外燈照射時長0 h”的熒光強度定義為I1FL0。圖7（a）的縱坐標表示紫外燈照射不同時長下N/Si-CQDs對應的熒光強度I1FL與I1FL0的比值，即為N/Si-CQDs經紫外燈照射不同時長后的熒光強度保留率（I1FL/I1FL0）。

圖7（b）的橫坐標表示NaCl水溶液濃度（0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mol/mL），本 研究 將“NaCl水溶液濃度為0 mol/mL”的熒光強度定義為I2FL0。圖7（a）的縱坐標表示N/Si-CQDs在不同濃度的NaCl水溶液中對應的熒光強度I2FL與I2FL0的比值，即為N/Si-CQDs在不同濃度的NaCl水溶液中的熒光強度保留率（I2FL/I2FL0）。本研究發現制備的N/Si-CQDs在6 h紫外燈照射后，熒光強度保留率為92.25%。此外，即使氯化鈉濃度高達0.1 mol/L，N/Si-CQDs的熒光強度保留率仍可達到98.90%。

圖7 （a）365 nm紫外燈照射時間對N/Si-CQDs熒光強度的影響；（b）不同濃度的NaCl對N/Si-CQDs熒光強度的影響；（c）不同pH對N/Si-CQDs熒光強度的影響。Fig.7（a）Effect of illumination time under 365 nm UV light on the fluorescence intensity.（b）Effect of NaCl concentrations on the fluorescence intensity.（c）Effect of pH on the fluorescence intensity.

本研究將“pH=4”的熒光強度定義為I3FL0，圖7（c）的縱坐標表示N/Si-CQDs在不同pH水溶液中對應的熒光強度I3FL與I3FL0的比值，即為N/Si-CQDs在不同pH的水溶液中的熒光強度保留率（I3FL/I3FL0）。如圖7（c）所示，隨著pH從4增加到10，N/Si-CQDs的熒光強度保留率為94.24%，FL在酸性和中性環境下幾乎保持不變。由于大多數的生物活性反應發生在這個pH范圍內，所以N/Si-CQDs在pH=4～10范圍內的高穩定性使其在生物應用中潛力巨大[27]。

由于N/Si-CQDs溶液的熒光強度FL與N/Si-CQDs在水介質形成的膠體和其形態穩定性高度相關。因此，本研究也進行了N/Si-CQDs 7 d內的吸光度穩定性實驗。我們發現，N/Si-CQDs水溶液在避光低溫（4℃）條件下儲存7 d后，吸光度基本維持不變（吸光度保持率大于98.7%），見圖S4。結合上述對N/Si-CQDs物理形貌和化學結構的表征分析，本研究推測N/Si-CQDs具有較高熒光穩定性的原因是N、Si雜原子的成功摻雜誘導形成了大量的表面官能團與表面缺陷。這其中N/Si-CQDs表面親水官能團的存在使N/Si-CQDs具有良好的水溶性；同時，N/Si-CQDs表面具有相同或近似的表面官能團與表面缺陷，容易造成N/Si-CQDs納米粒子具有相同的表面電荷進而造成N/Si-CQDs納米粒子間互斥，即在水中呈現出均勻單分散狀態，在水介質中形成膠體并具有一定的形態穩定性。不僅提高了N/Si-CQDs的熒光量子產率與熒光強度，同時也提高了N/Si-CQDs的熒光強度穩定性[5-6]。

3.3 N/Si-CQDs的細胞毒性與細胞成像分析

圖8為HEK293細胞與不同濃度N/Si-CQDs孵育24 h后的相對細胞活性。即使在較高的N/Si-CQDs濃度（200μg/mL）下，HEK293細胞的存活率（92.95%）仍然超過90%，這說明淡竹葉衍生的N/Si-CQDs具有優越的生物相容性[36]。

圖8 HEK293細胞與不同濃度N/Si-CQDs孵育24 h后的相對細胞活性Fig.8 Cell viability of HEK293 cells in the presence of diffferent concentrations of N/Si-CQDs for 24 h

綜上所述，N/Si-CQDs展現出的良好的水分散性、高熒光穩定性以及低細胞毒性，均證明其在細胞成像領域的應用潛力[3,38]。為此，本研究進行了體外細胞成像實驗，進一步測試了N/Si-CQDs作為細胞成像劑的可行性。圖9為N/Si-CQDs的熒光共聚焦細胞成像圖片。在含有N/Si-CQDs（200μg/mL）的培養基中孵育24 h后，在405 nm激發下，HEK293細胞質表現出綠色熒光，細胞形態正常。由此推測，N/Si-CQDs很容易通過內吞作用被細胞吸收,具有良好的細胞通透性，并明確區分細胞質和細胞核[43]。體外活細胞成像是研究活細胞的細胞結構和功能的重要手段，可進一步加深對細胞結構和功能的復雜性質的理解。本研究制備得到的N/Si-CQDs由于其亮度、光穩定性、可調諧的熒光發射、低毒性、廉價的制備等特性，是傳統的熒光探針在細胞成像領域內的有力替代品[1,15]。豐富的親水表面官能團與極小的粒徑使這種納米顆粒很容易與細胞膜相互作用，并通過內吞過程進入到細胞質中[27]，在細胞質中表現出綠色熒光，表明N/Si-CQDs可能具有標記特定的細胞器的能力，其光譜行為的變化與細胞和細胞器內的化學變化相對應的標記有望為生物醫學等相關領域研究提供助力[1,4]。N/Si-CQDs的低毒性使它們能夠在細胞中無害地實現細胞成像，這一結果與前人報道的生物質CQDs具有低細胞毒性、并可運用在細胞成像領域的研究結果一致[2]。因此，本研究制備得到的N/Si-CQDs有望作為熒光探針用于活細胞成像和其他生物醫學應用。

圖9 HEK293細 胞與N/Si-CQDs（200μg/mL）孵育24 h，在激發波長405 nm條件下的熒光圖像。Fig.9 Fluorescence image of HEK293 cells incubated with N/Si-CQDs（200μg/mL）for 24 h under excitation wavelength of 405 nm

4 結 論

本研究以熒光量子產率為指標，采用響應曲面法優化淡竹葉自摻雜碳量子點N/Si-CQDs的微波制備工藝，確定了微波作用時間（T）、微波功率（W）、淡竹葉與去離子水的料液比（R）對熒光量子產率這一指標的顯著性影響及其交互作用，確定了最佳工藝參數，并進行了驗證實驗。在實際最佳工藝條件下得到的N/Si-CQDs的水分散性良好、粒徑較小且分布均勻；具有激發依賴的熒光發射；N、Si雜原子成功自摻雜使N/Si-CQDs表現出良好的熒光穩定性，在長時間的紫外照射后與NaCl濃度范圍較廣的水溶液中熒光強度保留率較高；由于沒有化學試劑參與合成，該N/Si-CQDs即使在高濃度下也對HEK293細胞表現出較低的細胞毒性。此外，N/Si-CQDs能被HEK293細胞有效吸收，這表明該碳量子點在細胞成像等生物醫學領域具有良好的應用潛力。綜上所述，以淡竹葉為碳源，通過引入響應曲面法優化淡竹葉N/Si-CQDs的微波制備工藝，探究N/Si-CQDs在細胞成像中的應用價值，不僅為緊迫的廢棄生物質資源的高值化轉化利用提供了一條新思路，而且對于提高生物質碳量子點的微波法制備效率、促進其在細胞成像等生物醫學領域的應用具有參考價值。

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