單/同軸載SM藥/微球支架的制備及性能研究

陳宇彤，姜朝瑞，許 燕，張旭婧，印治濤

(新疆大學 機械工程學院，新疆 烏魯木齊 830047)

0 引言

骨結核是一種常見的肺外結核，其特征是在局部形成膿腫、肉芽腫、干酪樣壞死和隔離等病變。這些病變通常導致局部血液循環極差，抑制抗結核藥物通過血液運輸到達病灶，延長了口服維持藥物局部有效濃度的周期[1]。手術清創是治療骨結核的另一重要方法。然而，完全清除結核桿菌是極其困難的。術中病灶區未清理徹底的結核桿菌和口服抗結核藥物到達病灶區濃度較低導致的反復用藥是骨結核復發和產生耐藥性的根本原因。因此，改善和維持術后殘留腔內的抗結核藥物濃度已成為治療這一病癥的主要研究方向。

1995年，Grane等[2]提出骨組織工程學的概念。生物3D打印作為一種新興的制造技術，廣泛應用于骨組織工程支架(簡稱骨支架)的成型。生物3D打印技術通過CT掃描收集患者病灶處的骨缺損數據，使用計算機輔助設計，建立與骨缺損部位相匹配的3D模型，再根據需求選用合適的材料，使用生物3D打印設備制備出與病灶處尺寸和功能相匹配的骨支架，其優勢在于能夠打印出具有理想孔隙率和孔徑的支架，利于活性細胞黏附[3-4]。載抗生素的骨支架可控制感染，顯著提高抗生素的釋放可控性，改善細胞增殖、分化性能，有助于骨組織愈合[5]。載藥微球與骨支架的結合,不僅可在一定程度上控制支架的釋藥速率，還可提高藥物利用率,從而減少藥物對人體的損傷[6]。生物3D打印技術制備載藥微球骨支架已成為研究骨結核治療的主要技術手段。

羥基磷灰石(Hydroxyapatite, HA)又稱為羥磷灰石，是骨基質中的主要無機物，機械性能和生物性能較好，在骨領域中具有較好的再礦化作用及脫敏效果[7]。聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol，PVA)是一種具有親水性、粘接性、生物相容性和優良力學性能的高聚物，被廣泛應用于生物膠水、薄膜和納米纖維的制備[8]。Wang等[9]制備出PVA/HA骨支架用于骨缺損的治療，研究表明HA具有良好的生物相容性和機械性能，是一種理想的醫用可植入材料。絲素蛋白(Silk Fibroin,SF)約占蠶繭重量的70%，由于其具有非致癌性、無毒性、低免疫原性和良好的生物相容性、可降解性，被廣泛應用于生物醫學領域[10]。SF具有突出的韌性和機械強度，通過細胞增殖、生長以及遷移參與傷口愈合過程的不同階段來誘導傷口愈合[11]。劉海蘭等[12]選用磷酸鈣作為支架基材，單乳化法制備聚羥基丁酸羥基戊酸酯微球，得到復合體系的載藥微球支架，研究表明，適量的微球可增強復合支架的最大抗壓強度。安田田等[8]選用HA作為支架基材，通過正交實驗探究SF/PVA/HA之間的最優材料配比，制備SF/PVA/HA微球支架，研究表明，SF溶液濃度為3%，SF與PVA質量比為1∶5、SF/PVA水凝膠與HA的比為1.6 mL∶1 g時，支架具有優良的機械性能、生物安全性及較高的孔隙率。氧化石墨烯(Graphene Oxide, GO)具有較大的比表面積，能夠提高支架載藥量，同時具有低毒性、良好的降解性、抗菌性和親水性[13-14]。王博蔚等[15]以GO/SA/CS復合水凝膠為材料制備支架，研究發現，GO的加入使復合支架材料的溶脹比降低，降解性能和機械性能均得到了提升。鏈霉素(Streptomycin, SM)是臨床上治療結核病常用的一線藥物，通過與結核桿菌RNA結合，干擾結核桿菌蛋白質合成，破壞結核桿菌細胞膜的完整性，最終抑制或殺滅結核桿菌[16]。

本研究采用生物3D打印成型裝置，以HA作為支架基材，GO/PVA復合凝膠作為粘結劑，SM作為抗結核藥物，制備出單/同軸內芯載SM原藥、SF/SM載藥微球、GO/SF/SM載藥微球六組支架。分別對各組支架進行體外降解實驗、力學性能測試、藥物釋放實驗，對比選出滿足人體松質骨處缺損各性能要求的復合支架，為后期載藥微球骨支架應用于骨結核的臨床治療提供新思路。

1 實驗方法

1.1 試劑和儀器

絲素蛋白(SF)(自制)；氧化石墨烯(GO)溶液(南京先豐納米科技有限公司)；聚乙烯醇(PVA)(北京博奧拓達科技有限公司)；GO/PVA復合凝膠(自制)；羥基磷灰石(HA)(純度96%，粒徑40 nm，河南新源科技有限公司)；去離子水(上海穗天環保科技有限公司)；1× 磷酸鹽緩沖液(1× PBS)(pH=7.0～7.2，美國HyClone公司)；鏈霉素(SM)(上海源葉生物科技有限公司)；司盤-80(span-80)、溴化鋰(LiBr)、碳酸鈉(Na2CO3)(北京博奧拓達科技有限公司)；蛋白酶XIV(8.9 U/mL，上海源葉生物科技有限公司)。

掃描電鏡(SUPRA55vp，北京國鼎環科技術有限公司)；數顯恒溫水浴鍋(HH-1，金壇市城東新瑞儀器廠)；離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；高精度數字電子秤(浙江凱豐集團有限公司)；冷凍干燥箱(力辰科技有限公司)；數顯恒溫磁力攪拌器(常州越新儀器制造有限公司)；紫外分光光度計(浙江力辰科技有限公司)；恒溫震蕩器(浙江納德科學儀器有限公司)；微機控制電子萬能試驗機(WDW-20，方辰儀器設備公司)；自主研制3D打印成型裝置。

1.2 SM標曲方程

使用高精度電子秤稱量10 mg SM原藥與PBS混合，配置出100 μg/mL PBS混合液，將其分別稀釋為10 μg/mL、12.5 μg/mL、15 μg/mL、17.5 μg/mL、20 μg/mL；使用紫外分光光度計選定波長203 nm處測其吸光值。經實驗擬合得SM藥物標準曲線方程：Y=0.033 6X-0.001 7，相關系數R2=0.999。

1.3 SF溶液的制備

使用高精度電子秤稱取一定質量的蠶繭與Na2CO3溶液混合后置于磁力攪拌器中攪拌，30 min后用去離子水清洗脫膠，重復3次后將所得產物烘干；稱取脫膠的蠶繭20 g浸潤于80 mL的LiBr燒杯中，加熱攪拌1.5 h后裝入透析袋，用去離子水浸泡4 d，每4 h更換溶液；離心取上清液置得SF溶液，測其濃度為3.5%[17]。

1.4 載藥微球的制備及性能表征

采用乳化法制備GO/SF/SM微球。盛取一定量GO溶液與SF溶液共混為水相，置入盛有SM原藥的燒杯中攪拌待用；盛取一定量液體石蠟與span-80共混為油相置于燒杯中；將水相與油相混合反應一段時間后，加入有機溶劑異丙醇(C3H8O),溶液勻速攪拌，制得混合溶液；將混合溶液使用膠頭滴管垂直向下滴至離心管，離心去除上清液；加入C3H8O,溶液離心兩次去除上清液；加入PBS離心一次去除上清液；將其底部白色沉淀凍干1 d，即得GO/SF/SM載藥微球。SF/SM微球制備與其步驟相同[15]。微球形貌電鏡圖如圖1所示，SF/SM載藥微球，如圖1(a)所示，大部分微球發生黏連和團聚現象，僅得到少部分完整的微球，這對微球的載藥量和包封率均產生了一定的影響；GO/SF/SM載藥微球如圖1(b)所示，微球粒徑均勻、個體完整，幾乎未發生黏連和團聚現象，這是由于GO的分散性將各微球分離，較大的比表面積很好地包封了SM原藥[18]。

圖1 載藥微球SEM圖Fig.1 SEM image of drug-loaded microspheres

1.5 GO/PVA復合凝膠的制備

使用高精度電子秤稱取一定量的PVA晶體與去離子水混合加熱攪拌1 h后，即得PVA凝膠；超聲處理GO溶液(0.1 mg/mL)1 h后將其沿杯壁流至PVA凝膠中，攪拌均勻后，即得0.1%GO/PVA復合凝膠，待其冷卻至室溫，4 ℃冷藏保存備用。

1.6 載藥支架的制備

1.6.1負載SM原藥支架的制備

使用自制的3D打印成型裝置，設置打印速度為20 mm/h，制備出單/同軸載藥骨支架。其中，單軸載藥骨支架直徑為0.6 mm，尺寸為10 mm×8 mm×8 mm，載藥量約為20 mg；同軸載藥骨支架內徑為0.6 mm，外徑為0.84 mm，尺寸為10 mm×8 mm×8 mm，載藥量約為20 mg。

按溶質比為0.1∶1.4∶1分別稱取一定量SM原藥、GO/PVA復合凝膠及HA粉末于陶瓷坩堝中混合攪拌；待均勻后上料打印，即得負載SM原藥的單軸支架。

按溶質比為1.4∶1分別稱取一定量GO/PVA復合凝膠及HA粉末于陶瓷坩堝中混合攪拌，即得同軸支架的外芯材料，內芯材料制備過程與負載SM原藥的單軸支架相同。

1.6.2載藥微球支架的制備

將一定量的SF/SM載藥微球與SM原藥混合制備單軸載SF/SM微球支架，為便于后期對比分析，設定單個支架SM總藥量為20 mg。單軸GO/SF/SM微球的制備與單軸SF/SM微球的制備方法相同，仍需保證單個支架SM總藥量為20 mg。同軸支架內芯的制備與單軸載SM原藥支架的制備方法相同，外芯的制備與同軸載SM原藥支架外芯的制備方法相同。

1.7 成形單/同軸骨組織工程支架宏觀結構

單/同軸載藥/微球支架均成型效果良好，尺寸規整，達到制備預期效果。骨支架結構中的貫通孔徑尤為重要，合適的貫通孔徑利于活性細胞的黏附和遷移，利于SM藥物在病灶區的緩釋，可在后期體外降解和藥物釋放實驗中得出結論[19]。圖2是單/同軸載SM原藥支架圖，根據測量，除單軸載SM原藥支架，其余支架貫通孔徑均較大。

圖2 單/同軸載SM原藥支架圖Fig.2 Image of monaxial/coaxial scaffolds with SM drug-loaded

由于本研究中單軸支架基材與同軸支架內、外芯基材一致，呈灰白色，雖然載藥微球呈灰黃色，但經過支架基材的包封后，只呈現內芯材料的灰白色，故無法通過支架的宏觀形貌區分單軸支架與同軸支架。由于單、同軸支架中均包含支架基材、SM原藥與載藥微球，其微觀形貌無明顯區別，也無法通過支架的微觀形貌區分支架的單、同軸結構。單、同軸結構的形貌與性能差異僅能從下文中支架的降解、釋藥特性加以區分。因此，圖2中僅放置單/同軸載SM原藥支架圖，以展示支架宏觀形貌。

1.8 載藥骨支架體外降解研究

使用高精度電子秤稱取冷凍干燥處理后的各單/同軸載藥/微球支架，設置三個平行樣，避免誤差；稱取25 mg活性為8.9 U/ml的蛋白酶與223 mlPBS混合后使用膠頭滴管滴入盛有各支架的離心管，離心12周；其中，每2周取出支架干燥稱重，求加權平均值并計算降解率后更換PBS混合液。降解率(Dr)公式[20]如下:

(1)

式中:Dr為支架降解率；W0為單個支架初始質量，g；Wr為單位時間點稱取支架干燥后質量，g。

1.9 力學性能測試

將6組單/同軸載藥/微球支架平行樣分別置于壓縮試樣機的載物臺上進行壓力測試，設定最大負載為1 kN，位移速度為1 mm/min，計算各支架最大抗壓強度σmax和彈性模量E。最大抗壓強度σmax和彈性模量E公式分別如下：

(2)

(3)

式中:F為試件破壞時的最大載荷，KN；A為試件接觸面面積，mm2；σ為試件正應力，MPa；ε為應變；L為試件高度，mm;ΔL為軸向形變量，mm。

1.10 藥物釋放曲線

使用高精度電子秤稱重干燥后的各支架平行樣并記錄數據后與溶有活性蛋白酶的PBS混合離心12周，實驗開始2 d后取上清液5 ml冷藏，加入等量的含酶PBS繼續離心，每隔1周重復此操作[21]。12周后，使用紫外分光光度計測定各樣本吸光度，計算其體外累計釋藥率。

2 成形單/同軸骨支架性能對比分析

2.1 成形單/同軸骨組織工程支架降解微觀結構對比分析

為探究支架降解12周的微觀變化，沿縱垂線方向截斷支架，對斷面進行SEM檢測。由圖3(a)、(b)可以看出，單/同軸載SM原藥支架降解均勻，僅有少部分孔隙生成；對比圖3(a)、(c)與(b)、(d)發現，單/同軸載SF/SM微球支架截面存在較多的不規則孔隙，這進一步地驗證了載藥微球的加入加速了支架的降解；對比圖3(c)、(e)與(d)、(f)發現，GO的加入加速了支架的降解，使支架截面產生多個較大的不規則孔隙；由于同軸支架的內、外芯基材相同，使其具有較好的結合性，未出現明顯的內、外芯邊界，對支架降解未產生影響。

圖3 支架降解12周后斷面SEM圖Fig.3 SEM image of section on degradation of scaffolds after 12 weeks

2.2 降解性能對比分析

本實驗采用HA作為單/同軸骨支架的基材，制備出6組單/同軸載藥/微球支架。將支架置于含活性蛋白酶的PBS混合液中進行體外降解實驗，目的是使實驗更接近人的體液環境，從而使數據更具有說服力。從之前的研究中發現，HA降解率較低，故本實驗主要考察支架在2～12周內的降解情況。

圖4為單軸支架12周降解趨勢，從圖4可以看出，各單軸支架在2～4周降解速率較快且載SM原藥支架降解速率明顯高于載SF/SM微球支架，這可能是由于降解初期，藥物釋放速率大于微球裂解速率，載SM原藥支架中的SM藥物快速釋放使支架表面生成更多的孔隙，增加了支架與PBS混合溶液的接觸面積，從而加劇了降解速率，而載GO/SF/SM微球支架降解速率基本與載SM原藥支架保持一致，這可能是由于載藥微球中的GO具有良好的親水性和降解性，促進了載藥微球的降解；4～12周時載SM原藥支架降解趨于平緩，其余兩組支架降解速率與降解前期基本一致，這可能是由于載SM原藥支架中的SM藥物前期已基本釋放，而其余兩組支架隨著載藥微球中藥物的釋放，支架表面孔洞不斷增多，增加了支架與PBS混合液的接觸面積，并且各載藥微球均勻降解，與未降解的載藥微球形成動態穩定，使支架仍保持著較為均勻的降解速率；在整個降解過程中，單軸載GO/SF/SM微球支架表現出較優的降解率。

圖4 單軸支架12周降解趨勢Fig.4 Degradation trend of monaxial scaffolds in 12 weeks

圖5為同軸支架12周降解趨勢，從圖5可以看出，2～4周時，除同軸內芯載SM原藥支架，其余兩組載SM微球支架在各個降解階段均表現出較為均勻的降解速率，這可能是由于降解初期，隨著支架外芯的SM藥物的降解，外芯產生大量孔洞，這些孔洞致使內芯中SM藥物隨孔洞向外芯擴散，增大了與PBS混合液的接觸面積，同時隨著外芯HA的緩慢溶解，使支架表面孔洞增多，從而加快了支架整體的降解，而其余兩組支架內芯載SM微球的裂解速率低于藥物釋放速率，所以并無明顯的降解現象，保持了平穩的降解速率；4～12周時，由于同軸內芯載SM原藥中僅剩部分SM藥物和不易降解的HA，使其降解速率又趨于平穩，載SM微球的兩組支架中孔洞的增加和微球的降解維持著良好的動態穩定，使其與單軸載藥/微球支架情況類似，保持著良好的降解速率。

圖5 同軸支架12周降解趨勢Fig.5 Degradation trend of coaxial scaffolds in 12 weeks

對比圖4、圖5可以發現，相同時間內，單軸載藥/微球支架的質損量更高。表1為單/同軸載藥/微球支架12周降解率。結合表1可對比看出單軸載藥/微球支架的降解率略微高于同軸載藥/微球支架，降解率差為0.2%～1.36%。而單軸載SM原藥支架的降解率較同軸載SM原藥支架的降解率低0.33%，這可能是由于載藥微球中藥物的緩慢釋放形成了更多的孔洞，促進了PVA與HA的降解。12周后，單軸載SF/SM微球支架的降解率與同軸載SF/SM微球支架的降解率幾乎相同，這可能是因為雖然外芯結構中的HA與PVA較難降解，但由于降解前期，SM原藥的擴散致使外芯結構有較多的孔洞，給微球與PBS混合液提供了接觸通道，彌補了HA與PVA降解慢的缺陷，這也說明外芯結構的增加并不會降低同軸載藥/微球支架的降解速率。

表1 單/同軸載藥/微球支架12周后降解率Tab.1 Degradation rate of monaxial/coaxial drug-loaded microspheres scaffolds after 12 weeks

2.3 力學性能分析

表2為單/同軸支架降解2周后力學性能，由表2可得，當單/同軸載藥/微球支架降解了2周時，同軸支架的最大抗壓強度和彈性模量整體優于單軸支架，其中，最大抗壓強度相差2.22～2.67 MPa，彈性模量相差9.84～11.82 MPa，這意味著同軸支架中外芯結構的增加提高了支架的力學性能。

表2 單/同軸支架降解2周后力學性能Tab.2 Mechanical property of monaxial/coaxial scaffolds after 2 weeks of degradation

表3為單/同軸支架降解12周后力學性能，由表3可得，當降解了12周時，各支架力學性能明顯降低，這是由于隨著支架的降解，支架孔洞的增多，使支架結構變得疏松，力學性能大大降低。與第2周相比，最大抗壓強度降低了2.45～3.98 MPa，彈性模量降低了32.07～41.48 MPa，但值得一提的是，由于GO具有優異的理化性能，使同軸GO/SF/SM載藥微球支架仍具有較好的力學性能，滿足人體松質骨缺損處的力學強度要求。

表3 單/同軸支架降解12周后力學性能Tab.3 Mechanical property of monaxial/coaxial scaffolds after 12 weeks of degradation

2.4 釋藥性能分析

圖6為單/同軸支架累積釋藥率，由圖6可知，第0周時，單軸載SM原藥支架的累積釋藥率約為62.07%，同軸載SM原藥支架的累積釋藥率約為58.14%，這說明同軸結構使支架釋藥率降低了3.93%，優化了藥物突釋問題；隨著釋藥時間的增加，各支架累積釋藥率的差距日趨明顯，其中，同軸載GO/SF/SM微球支架1周累積釋藥率達65.85%，與單軸載GO/SF/SM微球支架相比，累積釋藥率降低了6.72%，12周后，同軸載GO/SF/SM微球支架的累積釋藥率達75.1%，比單軸載GO/SF/SM微球支架低5.21%，實現了載藥微球支架的藥物控釋和多級梯度緩釋:首先，同軸支架外芯的PVA/HA混合材料進行藥物緩釋，其次，GO/PVA/HA混合材料與未包封于微球的SM藥物進行藥物緩釋，最后，由SF包封的SM載藥微球進行藥物緩釋，這顯著地克服了藥物突釋問題并達到了平穩持續的藥物緩釋效果。

圖6 單/同軸支架累積釋藥率Fig.6 Cumulative drug-release rate of monaxial/coaxial scaffolds

3 總結與展望

本研究通過乳化法制備載SM微球，利用自制的3D打印成型裝置制備單/同軸載SM原藥支架、單/同軸載SF/SM微球支架與單/同軸載GO/SF/SM微球支架,通過實驗得出以下結論：

1) 通過12周體外降解實驗發現，微球的加入加速了支架的降解，同軸支架的外芯結構不會影響支架的降解，同軸載SF/SM微球支架與同軸載GO/SF/SM微球支架有較高的降解率。

2) 通過力學測試發現，同軸載GO/SF/SM微球支架的力學性能最優，雖然12周后力學性能有所下降，但仍滿足人體松質骨缺損部位的使用要求。

3) 通過12周釋藥實驗發現，同軸GO/SF/SM載藥微球支架優化了藥物突釋問題，實現了藥物控釋和多級梯度緩釋。

因此，本研究結果表明，同軸GO/SF/SM載藥微球支架能夠有效解決藥物突釋問題且具有一定的力學性能，對利用載藥骨支架治療骨結核引起的骨缺損具有一定的借鑒意義。下一步，為使載藥微球支架具有更好的力學性能和控緩釋藥物能力，將利用TPMS法對支架結構進行改良。