纖維基人工神經(jīng)導(dǎo)管的研究進(jìn)展

戴家木，聶 渡，李素英，張 瑜，張 偉，劉 蓉

(南通大學(xué) 紡織服裝學(xué)院，江蘇 南通 226019)

周圍神經(jīng)損傷(PNI)是一類難以治療的常見疾病，可引起感覺和運(yùn)動(dòng)障礙，發(fā)達(dá)國(guó)家每年發(fā)病率每10萬(wàn)人中約有13～23人[1]。盡管范圍較小的損傷(<5 mm)能夠依靠自身恢復(fù)能力實(shí)現(xiàn)再生，但依然會(huì)出現(xiàn)一定程度的功能缺陷和障礙。此外，較嚴(yán)重的PNI損傷無(wú)法自我再生，特別是粗神經(jīng)的遠(yuǎn)距離缺損，需要通過(guò)移植體進(jìn)行修復(fù)[2]。

自體神經(jīng)移植一直是神經(jīng)修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其避免了自體免疫的問(wèn)題，但在取材來(lái)源和數(shù)量上存在較大的弊端，且達(dá)到功能完全修復(fù)的概率很低，僅約50%的患者在自體神經(jīng)移植后能夠恢復(fù)4級(jí)肌力和感覺功能[3]。同種異體移植解決了取材方面的難點(diǎn)，但需要進(jìn)行一定的免疫處理后才可使用，因此，需要結(jié)合不同的策略來(lái)促進(jìn)神經(jīng)愈合[4]，而人工神經(jīng)支架(NGC)有望作為人工植入材料替代神經(jīng)自體移植物，在周圍神經(jīng)損傷后進(jìn)行組織修復(fù)。

目前，人工神經(jīng)導(dǎo)管材料的種類較為豐富，包括海綿[5]、水凝膠、微球及纖維。其中，纖維基神經(jīng)導(dǎo)管具有力學(xué)性能強(qiáng)、柔韌性好、定制性高等優(yōu)勢(shì)，在該領(lǐng)域一直是熱門的研究對(duì)象。本文主要從基材種類、制備方法、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、功能化改性和細(xì)胞培養(yǎng)等方面對(duì)NGC進(jìn)行介紹，并展望了纖維基人工神經(jīng)導(dǎo)管的發(fā)展前景。

1 基材種類

組織工程支架在制備和應(yīng)用方面需要考慮到較多重要因素，從基材選擇角度來(lái)說(shuō)，需要其具有合適的生物相容性、生物降解性和力學(xué)性能等。根據(jù)材料來(lái)源，可分為天然聚合物和合成聚合物，前者包括殼聚糖(CS)[6-7]、纖維素[8-9]、蛋白[10-13]、多肽[14]等，后者包括聚乳酸(PLA)[15]、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)[16]、ε-聚己內(nèi)脂(PCL)[17-18]、聚乳酸-聚己內(nèi)脂共聚物(PLCL)[19]等可降解材料，以及聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PEOT)[20]等不可降解材料。一般來(lái)說(shuō)，天然聚合物相較于合成聚合物具有較好的細(xì)胞親和力，但力學(xué)性能在濕潤(rùn)環(huán)境中相對(duì)較差，因此，在三維支架中以合成聚合物為主要原料的研究較多。

不同的材料具有不同的特性，當(dāng)以合成聚合物為主要原材料制備組織工程支架時(shí)，需要其具有適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能和降解速率等。PCL較為柔軟，韌性較好，但降解速率很低；而PLA具有較高的力學(xué)強(qiáng)度，雖然降解速率相對(duì)于PCL較快，但在體內(nèi)完全降解仍需要較長(zhǎng)時(shí)間；聚羥基乙酸(PGA)則因?yàn)榻到馑俾蔬^(guò)快而導(dǎo)致其在應(yīng)用方面嚴(yán)重受限。PLGA是PLA與PGA的共聚物，通過(guò)調(diào)控二者的比例能夠獲得較為適中的降解速率；類似地，PLCL是PLA與PCL的共聚物，通過(guò)調(diào)控共聚比例能夠得到更加合適的力學(xué)強(qiáng)度與柔韌性。除共聚物之外，不同合成材料之間的混合也能起到性能互補(bǔ)的作用，如PCL/PLA體系，提高PLA的比例能夠增強(qiáng)細(xì)胞黏附率和支架的力學(xué)強(qiáng)度[21]。除此之外，天然材料與合成材料的復(fù)合可改善支架對(duì)細(xì)胞黏附和增殖方面的能力，得到綜合性能優(yōu)異的支架材料，如CS-PLA接枝材料[22]、PLCL/絲素蛋白(SF)混合物[11,23]。

2 制備方法

神經(jīng)導(dǎo)管是一種柔軟的管狀物，采用聚合物纖維材料及其織物制備的人工神經(jīng)導(dǎo)管可滿足柔韌性方面的要求。通常情況下，纖維材料制備方法不同，所得到的纖維直徑也有區(qū)別，如使用靜電紡絲法制備納米級(jí)纖維[24-25]，熔融紡絲法等制備微米級(jí)纖維[8,22,26-27]，而對(duì)聚合物樣條進(jìn)行熱牽伸能夠得到毫米級(jí)纖維[28]。

微米級(jí)及毫米級(jí)纖維在力學(xué)性能上具有較高的優(yōu)勢(shì)，可提供足夠的拉伸和抗壓強(qiáng)度，作為植入體能較好地維持原有形態(tài)；但織物形式的導(dǎo)管具有較大的孔徑，可導(dǎo)致導(dǎo)管內(nèi)部物質(zhì)泄露，盡管可通過(guò)提高織物密度來(lái)降低孔徑，但難以制備小尺寸的導(dǎo)管，且柔軟性也會(huì)隨之降低。納米級(jí)纖維具有更高的比表面積、孔隙率和更小的孔徑，且其外形可較好地模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞黏附和增殖[10]。另外，取向的納米纖維能夠順利誘導(dǎo)細(xì)胞沿著取向方向增殖和遷移，十分有利于神經(jīng)再生[19]。需要注意的是，除利用靜電紡絲法制備納米纖維外，也可通過(guò)帶有異種電荷的2種物質(zhì)進(jìn)行自組裝得到，但該方法較難獲得取向納米纖維[14]。同時(shí)，使用接觸紡的方法也能夠得到納米纖維，相較于高壓電場(chǎng)下制得的納米纖維，接觸紡納米纖維的結(jié)晶度和彈性模量明顯較高[29]。根據(jù)纖維直徑的不同，在人工神經(jīng)導(dǎo)管制備和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)方面存在不同的思路，在材料功能化改性方面也具有不同的策略。

3 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

為適應(yīng)自體神經(jīng)導(dǎo)管的外形，人工神經(jīng)導(dǎo)管通常會(huì)被設(shè)計(jì)成具有相應(yīng)直徑的圓柱狀。同時(shí)，由于自體神經(jīng)纖維束由鞘層保護(hù)，因此，會(huì)進(jìn)一步將人工神經(jīng)導(dǎo)管設(shè)計(jì)成中空管道或?qū)嵭暮藲そY(jié)構(gòu)。其中，前者只有最外側(cè)的管狀外殼，后者是在前者的基礎(chǔ)上向管狀內(nèi)部填充水凝膠等材料。纖維基的外殼能夠提供較好的孔隙率，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子的滲透能力；水凝膠可產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)微環(huán)境，改善軸突再生，并增強(qiáng)髓鞘再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[6]。

除水凝膠外，實(shí)心導(dǎo)管的內(nèi)填充物還存在其他結(jié)構(gòu)物質(zhì)。Sun等[23]向中空導(dǎo)管中填充PLCL/SF三維納米纖維海綿(見圖1(a))，施萬(wàn)細(xì)胞(SCs)可從兩端不斷向納米纖維海綿內(nèi)部增殖和滲透，從而成功橋接坐骨神經(jīng)缺損，其對(duì)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)效果優(yōu)于中空導(dǎo)管。Huang等[12]首先使用模板法制備具有取向有序空腔的膠原蛋白(COL)/CS支架(見圖1(b))，之后在其外側(cè)沉積PCL納米纖維外殼用以防止成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，填充支架可提供足夠的力學(xué)性能，保護(hù)再生軸突免受壓縮應(yīng)力，同時(shí)為再生神經(jīng)提供足夠的空間；體外和體內(nèi)研究表明，該復(fù)合支架可促進(jìn)軸突再生和SCs遷移，其功能恢復(fù)能力與自體移植相當(dāng)。Hou等[5]也使用了相似的策略制備了以PLGA為外殼，以氧化細(xì)菌纖維素(OBC)/COL多孔海綿為填充物的神經(jīng)導(dǎo)管，得到了相似的結(jié)論，其能夠模擬神經(jīng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出比空心支架更好的修復(fù)效果。Singh等[30]通過(guò)二步法合成了具有良好彈性和韌性的抗氧化聚氨酯(PUAO)，并將其制備成取向納米纖維中空管道，在其中填充殼聚糖/明膠(CG)凍膠，并通過(guò)逐級(jí)冷凍的方法進(jìn)行制備，可誘導(dǎo)冰晶沿著一個(gè)方向進(jìn)行生長(zhǎng)，最終獲得較為一致的孔道方向，更好地引導(dǎo)SCs沿軸向生長(zhǎng)。

在中空導(dǎo)管的基礎(chǔ)上，其內(nèi)壁的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)能夠?qū)?xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律和神經(jīng)再生效果產(chǎn)生一定的影響。Koppes等[31]采用纖維熱拉伸技術(shù)，設(shè)計(jì)出具有不同幾何形狀和芯層尺寸的中空管狀神經(jīng)支架(見圖1(c))，以孤立的整個(gè)背根神經(jīng)節(jié)作為體外模型系統(tǒng)和神經(jīng)再生研究對(duì)象，證明矩形凹槽通道能夠強(qiáng)烈影響SCs遷移，促使軸突取向，加速軸突的生長(zhǎng)。

圖1 不同結(jié)構(gòu)的神經(jīng)導(dǎo)管支架材料的制備過(guò)程

纖維材料也能夠作為水凝膠增強(qiáng)材料來(lái)增強(qiáng)支架的神經(jīng)修復(fù)能力。Anarkoli等[16]將磁性PLGA納米纖維短纖添加到水凝膠前驅(qū)體中，短纖在磁場(chǎng)作用下取向排列，凝膠化后除去磁場(chǎng)得到的固定排列的纖維有助于形成水凝膠的各向異性結(jié)構(gòu)(見圖1(d))，與沒有纖維或具有隨機(jī)取向纖維的水凝膠相比，在該水凝膠中的成纖維細(xì)胞可單向生長(zhǎng)，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)延伸生長(zhǎng)。

4 功能化改性

為加速神經(jīng)組織的再生，對(duì)聚合物支架進(jìn)行功能化改性是十分有效的方法，目前研究較多的功能化方向主要包括導(dǎo)電處理、磁性處理、生長(zhǎng)因子負(fù)載、信使核糖核酸(mRNA)負(fù)載以及其他活性物質(zhì)的復(fù)合等。

4.1 導(dǎo)電處理

電刺激能夠在一定程度上調(diào)控細(xì)胞行為并進(jìn)行功能化連接，因此，向支架中引入導(dǎo)電性良好的添加劑可加速神經(jīng)修復(fù)。Wang等[11]在柞蠶絲納米纖維表面包裹氧化石墨烯(GO)，并經(jīng)透明質(zhì)酸還原后得到表面導(dǎo)電性良好的支架(見圖2(a))，通過(guò)對(duì)其施加微電流可增強(qiáng)SCs增殖和遷移，提高PC12細(xì)胞的分化能力，且黏著斑激酶(FAK)的表達(dá)能力得到上調(diào)。Meng等[32]利用SF、還原氧化石墨烯(rGO)和聚苯胺(PANI)之間的氫鍵和靜電吸附，制備了高導(dǎo)電性絲編織復(fù)合支架，其在不同的物理應(yīng)力下具有良好的導(dǎo)電穩(wěn)定性。Taheri等[8]通過(guò)將導(dǎo)電二硫化鉬(MoS2)納米薄片摻入到普通棉紗線中，經(jīng)過(guò)鋰離子插層處理后，制備具有導(dǎo)電性能增強(qiáng)的神經(jīng)導(dǎo)管支架，其高滲透性使得液體能夠充分浸潤(rùn)支架，神經(jīng)修復(fù)性能優(yōu)良。Jing等[33]將聚吡咯(PPy)聚合生長(zhǎng)在單軸取向的PLGA納米纖維表面，獲得導(dǎo)電能力，并將其填充在NGC導(dǎo)管中，能夠在細(xì)胞之間傳遞自發(fā)的電刺激。除表面導(dǎo)電修飾之外，也可將導(dǎo)電試劑加入到紡絲溶液中來(lái)制備導(dǎo)電纖維，Zhang等[34]將碳納米管(CNT)加入到PCL紡絲溶液中制備具有導(dǎo)電能力的取向納米纖維，表現(xiàn)出穩(wěn)健的細(xì)胞誘導(dǎo)行為，可增強(qiáng)軸突再生能力。

圖2 不同功能化纖維基神經(jīng)導(dǎo)管的制備方法

4.2 磁性處理

具有磁性的納米材料可在外部磁場(chǎng)下誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞軸突的延伸，通過(guò)激活有絲分裂原激活蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)的途徑來(lái)增強(qiáng)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，并提高支架的力學(xué)性能。Chen等[35]將褪黑素和Fe3O4磁性納米顆粒引入到PCL納米纖維中，構(gòu)成穩(wěn)定的緩釋體系(見圖2(b))，同時(shí)提供適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能，以及一定的抗氧化、抗炎性，促進(jìn)體內(nèi)再生坐骨神經(jīng)的形態(tài)、功能和電生理恢復(fù)。

4.3 生長(zhǎng)因子負(fù)載

組織工程中會(huì)使用各類生長(zhǎng)因子促進(jìn)組織再生，主要包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)[22,36-37]、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)[6]、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)[38]中的一種或者多種[4,39]。Hong等[17]利用順序靜電紡絲制備了3層納米纖維支架，第1層為PCL取向纖維，用于細(xì)胞黏附并向坐骨神經(jīng)分化，第2、3層分別為降解速率不同的2種PLGA納米纖維，用作NT-3、BDNF、PDGF多重生長(zhǎng)因子的緩釋載體(見圖2(c))。在對(duì)小鼠進(jìn)行坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)術(shù)后5周，其坐骨神經(jīng)指數(shù)和機(jī)械性異常性疼痛分析顯示，從第2層中快速釋放的NT-3和BDNF，以及從第3層中慢速釋放的PDGF可明顯加速神經(jīng)修復(fù)，且取向的PCL能夠提供細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的刺激，生成平行的坐骨神經(jīng)。

4.4 mRNA負(fù)載

mRNA能夠有效地調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞反應(yīng)，但由于其無(wú)法自行通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，因此，需要有效的非病毒傳遞平臺(tái)以及可直接從體外轉(zhuǎn)化為體內(nèi)的藥物篩選平臺(tái)[40]。Zhang等[18]使用PCL納米纖維作為底物來(lái)實(shí)現(xiàn)非病毒mRNA遞送，并將難以轉(zhuǎn)染的原代神經(jīng)元作為研究對(duì)象，結(jié)果表明，與常規(guī)推注遞送相比，無(wú)論神經(jīng)元的年齡和起源如何，該體系都可增強(qiáng)神經(jīng)元的基因沉默，且術(shù)后2周可觀察到良好的神經(jīng)再生現(xiàn)象，證明了纖維載體的潛力。一般情況下，生長(zhǎng)因子的引入能夠提高細(xì)胞的mRNA的表達(dá)能力，而mRNA的引入則可直接產(chǎn)生作用，表達(dá)出對(duì)應(yīng)的蛋白類生長(zhǎng)因子，因此，能夠起到相輔相成的協(xié)同作用。

4.5 其他活性成分復(fù)合

除上述生長(zhǎng)因子及mRNA等添加成分之外，一些藥物在某些方面也具有促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的功能。如Jahromi等[15]以左旋聚乳酸(PLLA)/多壁碳納米管(MWCNT)納米纖維為外殼制備NGC，其管道中添加了SCs和姜黃素載藥微球，結(jié)果表明姜黃素的緩慢釋放可降低SCs的凋亡，同時(shí)MWCNT的加入能夠降低NGC的膨脹率，并提高其力學(xué)性能，修復(fù)效果與自體移植修復(fù)相似。Wu等[41]使用層粘連蛋白作為改性劑接枝在PLGA紗線/納米纖維支架上，可明顯提高SCs的增殖能力并誘導(dǎo)SCs的軸向遷移能力(見圖2(d))。Almansoori等[42]通過(guò)直流磁控濺射法將金屬鉭(Ta)鍍層在PLA納米纖維表面，可明顯提高SCs的活力和增殖能力，愈后無(wú)疤痕。

5 細(xì)胞培養(yǎng)

在組織再生速率方面，細(xì)胞在支架上的增殖方式起到了十分重要的作用。體外測(cè)試時(shí)多數(shù)情況下為靜態(tài)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間后，培養(yǎng)基中各種成分會(huì)出現(xiàn)分布不均等現(xiàn)象，這在一定程度上會(huì)降低細(xì)胞增殖速率。另外，不同種類的細(xì)胞具有不同的活性和功能，神經(jīng)再生方面最常用的為PC12細(xì)胞系和SCs。然而，由于SCs的可及性差，NGC上種子細(xì)胞的覆蓋不足，可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)在長(zhǎng)間隙中無(wú)法再生并無(wú)法完全恢復(fù)功能，因此，Zhou等[36]提出了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)和旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)，其保留生長(zhǎng)因子的生物活性，并在體外實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放，在NGF和RCCS的幫助下，帶有種子BMSCs的NGC可以增強(qiáng)長(zhǎng)神經(jīng)損傷間隙的周圍神經(jīng)再生。

由于細(xì)胞在支架上的增殖方式是逐步向外擴(kuò)張的，從導(dǎo)管兩端向內(nèi)的擴(kuò)張速率較慢，因此，通過(guò)改變細(xì)胞的接種位置也會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖和遷移模式產(chǎn)生影響。Sun等[43]利用空間受限的細(xì)胞分泌組法，將干細(xì)胞封裝在中央1/3內(nèi)的導(dǎo)管，可在術(shù)后6周內(nèi)表現(xiàn)出對(duì)SCs遷移的促進(jìn)作用，并在第16周時(shí)，大鼠表現(xiàn)出明顯運(yùn)動(dòng)功能增強(qiáng)和軸突髓鞘形成。

6 結(jié)束語(yǔ)

人工神經(jīng)導(dǎo)管仍然是神經(jīng)再生治療的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，本文綜述了以纖維為基體的人工神經(jīng)導(dǎo)管發(fā)展現(xiàn)狀，主要包括基材種類、制備方法、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、功能化改性及細(xì)胞培養(yǎng)等，由于其高度可定制化的特性，能夠制備具有功能優(yōu)良且豐富的支架材料，提供神經(jīng)愈合速率，因此，在該領(lǐng)域具有十分重要的研究意義。

1)微米級(jí)及納米級(jí)纖維材料在人工神經(jīng)導(dǎo)管方面研究較為廣泛，通過(guò)不同的制備方法可獲得在一定性能方面有所提升的纖維材料，如：對(duì)纖維進(jìn)行改性后可賦予其一定的導(dǎo)電性，在電場(chǎng)下誘導(dǎo)細(xì)胞加速分化；通過(guò)生長(zhǎng)因子的負(fù)載，加速細(xì)胞的增殖和分化能力。

2)從纖維種類方面來(lái)說(shuō)，納米纖維基神經(jīng)導(dǎo)管的研究比微米級(jí)材料要多，其原因在于神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)的主要關(guān)注點(diǎn)在于細(xì)胞的增殖與分化，對(duì)于材料的強(qiáng)度無(wú)過(guò)多要求，因此，雖然微米級(jí)纖維表現(xiàn)出更強(qiáng)的力學(xué)性能，但納米纖維能夠提供更好的細(xì)胞黏附和增殖的場(chǎng)所。

3)目前研究較多的是ε-聚己內(nèi)脂(PCL)基人工神經(jīng)導(dǎo)管，其具有優(yōu)良的柔韌性和生物相容性，但生物降解速率較慢，現(xiàn)有的文獻(xiàn)中鮮有關(guān)于PCL降解速率與神經(jīng)導(dǎo)管再生速度的研究。

4)現(xiàn)有報(bào)道中，神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)部的填充物有水凝膠、海綿等，可加速神經(jīng)導(dǎo)管的修復(fù)，其效果優(yōu)于中空導(dǎo)管，但修復(fù)機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的探討和闡釋。

基于目前相關(guān)報(bào)道，人工神經(jīng)導(dǎo)管在原材料選取、制備方法、功能化改性、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、生物學(xué)評(píng)價(jià)等方面還需要進(jìn)一步的改進(jìn)，作為交叉學(xué)科，因人工神經(jīng)導(dǎo)管具有高度的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和用于疾病治療的重要性，需要多各學(xué)科領(lǐng)域的專業(yè)人士相互合作才能在現(xiàn)有水平上取得突破。