2 型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑的菌群結構及功能分析

楊嵐，張佳明，方梅飛，黃玉曉，蔣蘭嵐，陶人川

1 廣西醫科大學附屬口腔醫院牙周粘膜科，南寧 530000；2 廣西壯族自治區衛生健康委員會口腔感染性疾病防治重點實驗室；3 廣西口腔頜面修復與重建研究自治區級重點實驗室；4 頜面外科疾病診治研究重點實驗室；5 廣西顱頜面畸形臨床醫學研究中心

2 型糖尿病是一種環境和/或遺傳因素引起的，以糖代謝異常為主要特征的慢性疾病［1］。我國是目前全球患糖尿病人數最多的國家，其中90%以上的患者為2 型糖尿病［2］。臨床研究［3］表明，2 型糖尿病可升高牙周炎的患病風險及病情嚴重程度，牙周炎也可影響患者的血糖控制［4-5］。口腔微生物是糖尿病與牙周炎相互作用的聯系機制之一，微生物可通過各種酶、毒素及代謝物等發揮炎癥作用，促進2型進糖尿病發展，同時糖尿病引起的人體IL-17上調可導致口腔微生物群的致病性更強［6］。近年來逐漸有學者［7］采用16S rDNA 擴增子測序技術分析健康牙周狀態與牙周炎癥狀態下的齦下微生物顯著差異，但16S rDNA 測序技術往往只能檢測到菌屬或部分菌種，精確度有限。隨高通量測序技術的發展，鳥槍法宏基因組測序技術能鑒定更多的物種并進一步分析微生物基因編碼的各項功能［8］。目前，關于2型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑微生物群落結構組成及其功能相關報道較少。為此，我們運用鳥槍法宏基因組測序技術，對2 型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑中的菌群結構及功能進行分析，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019 年7 月—10 月在廣西醫科大學附屬口腔醫院牙周黏膜科就診的單純牙周炎患者3 例、廣西醫科大學第一附屬醫院內分泌科門診就診的2 型糖尿病患者包括伴牙周炎患者2 例不伴牙周炎患者2 例，及性別及年齡相匹配的健康志愿者3 例。2 型糖尿病患者包括伴牙周炎患者年齡（65.50±9.89）歲，空腹血糖（6.90±0.14）mmol/L，糖化血紅蛋白C（HbAlc）6.66%±0.51%，牙周探診深度PD（4.32 ± 1.52）mm，附著喪失AL（4.53 ±1.40）mm；2 型糖尿病不伴牙周炎患者年齡（66.50±2.12）歲，空腹血糖（5.48±0.18）mmol/L，HbAlc6.11%±0.27%，PD（2.46±0.07）mm；單純牙周炎患者年齡（47.67 ± 3.79）歲，空腹血糖（5.30 ±0.26）mmol/L，HbAlc ＜6.50%，PD（4.55 ±0.57）mm，AL（4.55 ± 0.57）mm；健康志愿者年齡（46.00±8.72）歲，空腹血糖（5.00±0.26）mmol/L，HbAlc ＜6.50%，PD（2.19 ± 0.09）mm。糖尿病患者納入標準：①2 型糖尿病病情穩定1 年以上，無其他嚴重并發癥；②3 個月內用藥、飲食和運動習慣均無明顯改變。牙周炎患者納入標準：至少兩顆不相鄰患牙的鄰間附著喪失或至少兩顆牙的頰唇/舌腭側臨床附著喪失≥3 mm 伴牙周袋＞3 mm。排除標準：①有長期吸煙病史、飲酒史；②口腔或者其他部位有明顯急性感染；③3 個月內有使用抗生素、激素；④3 個月內接受過潔治、刮治等牙周治療；⑤全口天然牙＜20 顆。本研究經廣西醫科大學倫理委員會批準（倫理號：2020010），與受試者簽署知情同意書。

1.2 受試者齦下菌斑菌群結構及功能分析

1.2.1 齦下菌斑采集及細菌DNA 提取 受試者禁食2 h，選取2 型糖尿病伴牙周炎患者與單純牙周炎患者每個象限牙周袋最深位點為采樣位點，隨機抽取2 型糖尿病不伴牙周炎患者及健康者4 個位點作為采樣位點。清除擬采樣牙的齦上菌斑，使用無菌Gracy 刮治器，刮取齦下菌斑，并置入含0.25 mL ddH2O的凍存管中，置入液氮凍存。采用E.Z.N.A.Stool.?DNAKit 試劑盒提取各齦下菌斑樣本中的DNA，50 μL Elution buffer 洗脫，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，-80 ℃保存備用。

1.2.2 齦下菌斑菌群結構及功能分析 用聯川自主研發的試劑盒進行paired end文庫構建，文庫質檢合格后用HiSeq4000 進行高通量測序，測序模式為PE150。文庫構建主要步驟如下圖所示，包括：基因組DNA 用超聲打斷、DNA 片段末端修復、加′A′ 堿基至DNA 片段的3’末端、加測序接頭、片段選擇、PCR擴增、文庫質檢、上機測序。本部分由聯川生物有限公司協助完成。使用cutadapt v1.9軟件獲取測序數據，利用fqtrim v0.94 軟件對低質量的reads 進行裁剪，bowtie2 v2.2.0 軟件將reads 與宿主基因組進行比對，去除宿主污染。通過IDBA-UD 軟件重新組裝經過質量過濾的reads，以構建每個樣本的宏基因組。利用MetaGeneMark v3.26軟件預測宏基因組contigs 的所有編碼區域（CDS，Coding Region），根據預測結果進行過濾和去冗余，隨后通過CD-HIT v4.6.1 軟件聚類得到unigenes，并計算各基因在每個樣品中的豐度信息以估算樣本的Unigene 豐度。利用過DIAMOND v 0.7.12 軟件對unigenes 與NCBI NR 數據庫進行比對，選取evalue≤最小evalue*10 的比對結果進行物種分類。結合NCBI 的物種分類系統，通過與MEGAN 軟件相似的LCA（Lowest Common Ancestor）算法，分析菌群的結構。同時將得到unigenes 與KEGG 數據庫進行比對，進行功能注釋。基于unigenes的分類和功能注釋，以及unigenes的豐度譜，在分類或功能水平上進行分析。

1.3 統計學方法 選用SPSS26.0 統計學軟件。正態分布檢驗采用Shapiro-Wilk 檢驗，符合正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 受試者齦下菌斑的菌群結構 4 組樣本檢測結果共分類菌種界5 個、門64 個、綱127 個、目246個、科448 個、屬1 389 個、種4 697 個。在種水平上分析，2 型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑中豐度排名前5 的菌種依次為齒垢密螺旋體、牙齦卟啉單胞菌（、中間密螺旋體、福賽坦氏菌、文氏密螺旋體，相對豐富分別為28.47%、23.52%、14.22%、10.74%、10.73%；單純牙周炎患者齦下菌斑中豐度排名前5的菌種依次為牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體、福賽坦氏菌、索氏密螺旋體、中間密螺旋體，相對豐度為30.84%、27.06%、13.88%、7.62%、7.27%；2 型糖尿病不伴牙周炎患者齦下菌斑齦下菌斑中豐度排名前5 的菌種依次為Actinobaculum sp.oral taxon183、馬氏棒狀桿菌、戈氏放線菌、齒垢密螺旋體、具核梭桿菌，相對豐度分別為16.91%、15.83%、13.00%、12.21%、12.04%；健康志愿者齦下菌斑齦下菌斑中豐度排名前5 的菌種依次為齒垢密螺旋體、馬氏棒狀桿菌、Lautropia mirabilis、具核梭桿菌、Actinobaculum sp.oral taxon183，相對豐度分別為18.44%、16.17%、16.10%、12.67%、7.33%。根據齦下細菌的聚集特性，進一步分析齦下菌斑的微生物復合體分布情況，2 型糖尿病伴牙周炎患者及單純牙周炎患者齦下菌斑中的紅色復合體（牙齦卟啉單胞菌、福賽坦氏菌、齒垢密螺旋體）豐度均＞60%，高于2 型糖尿病不伴牙周炎患者和健康志愿者（P均＜0.05）。

2.2 受試者齦下菌斑基因組功能分析 2 型糖尿病伴牙周炎患者、2 型糖尿病不伴牙周炎患者、單純牙周炎患者及健康志愿者的齦下菌斑基因組注釋得到的基因數目分別為3 489、3 116、3 415、3 269 個，差異明顯的基因有41 個。將差異表達的基因注釋到KEGG pathway，發現四組的陽離子抗菌肽抵抗［Cationic antimicrobial peptide（CAMP）resistance］、甘油脂代謝（Glycerolipid metabolism）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、雙組分系統（Two-component system）、碳代謝（Carbon metabolism）、One carbon pool by folate、Terpenoid backbone biosynthesis、DNA修復（DNA replication）、生物素代謝（Biotin metabolism）及ABC 轉運系統（ABC transporters）等通路富集有差異，其中雙組分系統、碳代謝及ABC 轉運系統通路在2型糖尿病伴牙周炎患者的齦下菌斑中富集明顯。

3 討論

2 型糖尿病是最常見的與牙周炎發生發展相關的系統性疾病之一，兩者之間的聯系主要集中在代謝改變和免疫紊亂，包括氧化應激、免疫系統細胞因子分布的改變和細胞受體的調節等［9］，口腔微生物變化的相關研究比較缺乏。本研究使用高分辨率鳥槍法測序技術，初步探討齦下菌斑中的菌群結構及功能，從微生物的角度研究2 型糖尿病和牙周炎之間的聯系。我們發現2型糖尿病伴牙周炎患者與單純牙周炎患者的齦下菌群相比較，菌種分布相近。早期研究［10］認為，糖尿病的存在對牙周微生物群的組成無顯著影響，而且糖尿病患者的血糖控制水平對齦下生物膜的組成也無顯著影響，這可能是由于傳統技術如體外培養和DNA-DNA 雜交的局限性，許多低豐富度的物種無法被檢測到，存在顯著的偏見，不能充分研究微生物多樣性。但隨著高通量測序技術的出現，有研究［11］通過16S rDNA 測序探索了糖尿病患者牙周微生物組成之間可能的關聯，發現了糖尿病患者齦下微生物組成不同的證據。

我們前期通過16S rDNA 測序也發現各組微生物組成在門、屬等層面存在差異。此次采用宏基因組鳥槍法測序技術進行菌種分析，發現在菌種層面2 型糖尿病對齦下菌群分布無顯著影響。牙齦卟啉單胞菌是牙周炎病變區最主要的致病菌，單純牙周炎患者齦下菌斑中的牙齦卟啉單胞菌相對豐度高于2型糖尿病伴牙周炎患者，這可能是2型糖尿病患者對牙周病原體耐受性，能較早地表現出牙周炎狀態［12］。按齦下細菌的聚集特性及與牙周狀況的關系，通常將齦下細菌分為6個主要復合體［13］，分別以紅、橙、黃、綠、紫、藍表示，與牙周炎的緊密相關關系度由高到低排列［14］。進一步比較有無牙周炎患者的齦下微生物發現，與牙周炎發生密切相關的紅色復合體在2型糖尿病伴牙周炎和單純牙周炎患者中呈高豐度的趨勢。健康志愿者和2型糖尿病不伴牙周炎患者的紅色復合體呈低豐度分布，且無明顯差異。上述結果表明2型糖尿病對牙周病復合體的分布可能無顯著影響。

本研究進一步分析2 型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑中的菌群在不同疾病狀態下富集明顯的功能通路，這些通路主要涉及能量代謝、脂代謝、氨基酸代謝，是微生物的重要代謝途徑。其中信號傳導途徑雙組分調節系統、碳代謝及ABC 轉運系統通路在2 型糖尿病伴牙周炎患者的齦下菌斑中富集明顯。雙組分調節系統常見于革蘭陰性菌，可靈敏地感知生存環境地變化，幫助微生物適應不同的宿主環境。有研究［15］發現，糖尿病患者唾液中葡萄糖水平升高可導致口腔環境酸化，齦下微生物可能通過上調雙組分調節系統的基因表達，從而適應糖尿病對口腔微環境的影響。雙組分調節系統還可通過調節IX 型分泌系統的基因表達來調節牙齦卟啉單胞菌中毒力因子的成熟和運輸，如牙齦素和肽酰基精氨酸脫亞胺酶等［16］。同時微生物碳代謝過程產生的戊糖、葡萄糖醛酸、抗壞血酸、丁酸鹽等代謝物與牙周炎的發展密切相關，其中微生物產生的丁酸鹽被認為是牙周炎癥的代謝標志［17］，同時丁酸鹽也可以影響胰島素敏感性。ABC轉運系統是病原體獲取營養的主要運輸蛋白，可吸收其生態系統中獨特的營養物質，如病原體可通過轉運系統吸收形成生物膜的關鍵成分鐵［18］。另外ABC轉運系統還編碼多種大分子出口，以抵御宿主環境中的抗菌素［19］，說明這些途徑可能提供了2型糖尿病和牙周炎之間的聯系機制。

綜上所述，2 型糖尿病伴牙周炎患者和單純牙周炎患者齦下菌斑中的菌群結構相似，以紅色復合為主，進一步進行齦下菌斑基因組功能發現存在差異，其中與致病相關的功能基因在2 型糖尿病伴牙周炎患者齦下菌斑中富集明顯，主要集中在代謝方面。因此，研究齦下菌群代謝的變化情況可能是進一步探討2型糖尿病與牙周炎之間聯系的新方向。