惡性腫瘤嗜神經浸潤的體內外模型研究進展

駱驚濤

天津醫科大學腫瘤醫院頜面耳鼻喉腫瘤科國家腫瘤臨床醫學研究中心天津市腫瘤防治重點實驗室天津醫科大學腫瘤醫院天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津 300000

惡性腫瘤嗜神經浸潤（PNI）指腫瘤細胞侵及神經外膜、神經周膜或神經內膜并出現局部侵襲和沿其延伸方向轉移的現象，腫瘤細胞存在于任何3 層神經膜內或包繞神經外膜1/3 周長以上均可視為PNI［1］。PNI 常見于胰腺癌、頭頸部癌、前列腺癌、胃癌、結腸癌等，可以導致癱瘓、疼痛，并且與癌癥復發率增加和患者生存率降低有關，是導致預后不良的重要因素［2］。PNI 可在沒有淋巴或血管侵犯的情況下發生，并被認為是惡性腫瘤轉移的初始步驟［3］。針對惡性腫瘤的PNI的治療可以防止腫瘤向脊髓的局部擴展，保護神經功能，減少神經侵犯引起的疼痛，最終延長患者生存率［4］。近年研究發現，PNI 中存在多種分子和途徑，可通過神經生長因子等因子的驅動來影響惡性腫瘤的發生發展。然而由于缺乏一致的、可重復性的研究方法，很難對PNI相關通路的機制進行體外及體內研究，建立合理的嗜神經浸潤模型對PNI 相關機制的研究至關重要。基于此，本研究就PNI 的體內、體外模型作一綜述，以期為PNI提供更加精確合理的研究方法。

1 PNI的體外模型

1.1 腫瘤細胞與背根神經節（DRG）體外共培養模型 DRG 是一種細胞體，參與糖尿病神經病變的發生發展，DRG 感覺神經元的胞體是研究軸突再生的模型之一［5-6］。HUYETT 等［7］建立了頭頸部鱗癌細胞Fadu與小鼠DRG 共培養模型，該模型對頭頸部鱗癌細胞的培養方法、小鼠DRG 的解剖、培養基的制備、如何將DRG 插入到半固態基質液滴、如何放置頭頸部鱗癌細胞作了詳細介紹。該模型最重要的步驟是精確解剖和提取DRG，脊柱的適當橫斷和中線—縱向分成兩個半棘是獲得大量DRG 的關鍵。在解剖單個DRG 時，切勿直接處理神經節，而應用顯微鏡鉗夾住周圍的筋膜。DRG 的擠壓損傷是軸突生長失敗的主要原因，過度處理DRG 可導致軸突難以生長。該模型的優點是具有非常高的成功率和可重復性，總實驗時間也相對較短，使用活細胞成像可以在時間推移視頻形式下觀察軸突生長過程和頭頸部鱗癌細胞侵襲。該模型在細胞接種前1 h 加入熒光細胞染色劑，可以自由穿過細胞膜，而在與細胞內的巰基反應后，染色仍留在細胞內，并傳遞到子細胞。熒光染色可促進檢測中的可視化，因為熒光能夠存在2～3 d，與頭頸部鱗癌細胞Fadu 發生神經浸潤的時間框架相同。同時，該模型在熒光染色時還允許使用多種不同的顏色，并且不需要創建熒光蛋白轉染的細胞系，熒光染色細胞的加入在腫瘤細胞和背景物質之間產生了非常明顯的分化，更加易于觀察。但該模型也存在技術局限性：①由于該模型采用非常細小的神經突起替代大量的神經浸潤，因此目前尚不能明確軸突相對于神經元在活體中的作用；②研究中缺乏體外腫瘤環境中固有的外源性因子；③由于成纖維細胞外流和基質完整性的喪失，可以研究PNI的時間被限制在48 h內。這些局限性的存在可能導致某些具有神經侵襲功能但分裂或侵襲緩慢的細胞系被遺漏，并被推定為不具備PNI 的能力。該模型還介紹了一種量化PNI 結果的評分系統，將檢測圖像分為具有垂直線和水平線的四個象限，如果任一象限至少具有一串腫瘤細胞由基質邊緣向GRG延伸而發生PNI則計1分，若發生PNI的腫瘤細胞從基質邊緣延伸到DRG 的路徑超過50%則計2分，通過這種方式，可以分配0～8 分的分數。該分析方法主要優點為能夠快速分析出許多PNI細胞的分數，缺點為不能充分表達PNI的程度（一個象限有1 個神經突起，侵犯到DRG 的距離為100%，得到的分數為2 分，與有10 個類似侵襲軸突的象限所得到的分數相同）。該模型常用于體外研究神經元與腫瘤細胞間旁分泌的相互作用，其可根據測試假設對微環境進行修改，如在培養皿中加入第三種細胞培養物（例如非癌細胞）使研究人員能夠比較不同細胞的嗜神經遷移能力；此外，研究人員還可以應用不同的條件（溫度、濕度、可溶性因素等）并檢測其對細胞侵襲能力的影響。但由于該模型使用的是小鼠DRG，小鼠細胞可能與人類細胞不相容，所以當使用人類腫瘤細胞時，并不是總會表現出鼠—人蛋白—蛋白的相互作用。因此，當計劃對兩個不同的物種使用該模型時，應測試所檢查蛋白質的同源性，若同源性高，則該模型可適用于評估蛋白質—蛋白質的相互作用。

1.2 腫瘤細胞與神經外植體共培養模型 ABIATARI 等［8］在無菌條件下解剖大鼠迷走神經頸部約5 mm 的部分，并距離室底0.7 mm 放置在專門設計的神經侵犯室中；將培養箱放置在含有標準培養基的組織培養板上，將胰腺導管腺癌細胞PDAC 胰蛋白酶化，再懸浮于培養基中，將細胞懸液灌入培養箱，以此方法獲得三種神經浸潤侵襲性胰腺癌細胞；將神經從侵入室取出，10% 甲醛固定并用石蠟包埋；免疫組織化學法檢測神經中的腫瘤細胞侵入情況。需要注意的是，為了避免該模型出現“假克隆”，神經室中的培養基水平要保持高于板中的培養基水平，并在整個實驗過程中進行控制，以排除培養基/細胞懸浮液從神經室中泄漏的情況。

1.3 腫瘤細胞與施萬細胞共培養模型 施萬細胞是周圍神經系統中主要的神經膠質細胞，其可能是促進腫瘤生長和疼痛的炎癥介質的主要來源［9］。研究顯示，腫瘤細胞可利用施萬細胞的典型功能促進PNI［10］。SU 等［11］建立了腫瘤細胞與人施萬細胞之間的體外共培養系統。將5×105個人施萬細胞接種在六孔板的底部，同時將5×105個腫瘤細胞（人轉移胰腺腺癌細胞AsPC-1、人胰腺癌細胞MIA PaCa-2）加入孔徑為0.4 μm 的上部Transwell 嵌件。將共培養系統與完整培養基分別保持24 h 或48 h 用于RNA提取或共培養條件培養基收集。該模型模擬了腫瘤細胞與施萬細胞之間的相互作用，使研究者能夠觀察其生物學行為的變化，重現體內腫瘤細胞神經轉移的過程。但體內微環境很難復制，該系統未能模擬體內兩種細胞相互作用時的酸堿度、CO2濃度、營養等情況，有待于后期進一步改善。

1.4 腫瘤細胞與PC-12 神經元細胞/50B11 神經元細胞共培養模型 PC-12 是經典的神經元模型，而50B11 是永生的DRG 感覺神經元細胞系，兩者均適用于模擬 PNI 的臨床觀察［12］。YIN 等［13］在 Matrigel中培養分化的PC-12/50B11 細胞，然后將熒光標記的腫瘤細胞添加到培養基中，使腫瘤細胞廣泛分散，以增加與大量單個神經突起相互作用的機會。同時，在空白基質凝膠周圍種植熒光腫瘤細胞，在相同的實驗條件下，獨立于與神經細胞的外部相互作用。該模型可評估自主腫瘤細胞侵襲，通過定量測定局限于腫瘤—神經細胞的含神經突基質凝膠中的熒光癌細胞來確定癌細胞的神經侵襲能力。

2 PNI的體內模型

2.1 小鼠原位胰腺腫瘤的神經侵襲和轉移模型JURCAK 等［3］將小鼠剖腹，將懸浮于20 mL 磷酸鹽緩沖鹽水中的胰腺導管腺癌基因工程小鼠腫瘤細胞注入小鼠胰腺，注射后第10 天對胰腺腫瘤區進行HE染色、蘇木精和神經特異性標記物TUJ1免疫組化染色，觀察并分析神經密度及神經數量。

2.2 將同基因胰腺癌細胞注射到坐骨神經中進行神經侵襲的活體小鼠模型 ZHANG 等［14］將同基因胰腺癌細胞注射到小鼠坐骨神經中建立了PNI的體內模型，該模型使用異氟醚麻醉4周大小的裸鼠，暴露麻醉小鼠的坐骨神經并注射胰腺癌細胞，使胰腺癌細胞從注射點向脊髓近端侵入神經，然后評估小鼠肢體功能和坐骨神經功能指數以評估PNI的嚴重程度。在該模型的制備過程中需要仔細處理3個關鍵步驟：①腫瘤細胞注射：注射腫瘤細胞時要非常小心，刺穿神經的后壁會導致腫瘤細胞損失。一旦針頭就位，注射應緩慢而穩定地進行5 s 以上，以防止液壓力將腫瘤細胞從注射點向前推進得太遠。注射后應在神經上留置針3 s，可減少回流和腫瘤細胞滲漏。②提取侵入的神經：在坐骨神經提取過程中，由于被侵犯的坐骨神經非常脆弱，解剖時需非常輕柔，以防止被侵犯的神經斷裂。③采集神經的處理：神經的整個長度必須完全平放在模具上。該模型同時也存在一定的局限性：①雖然在手術過程中對神經的處理盡量輕柔，但仍不可避免神經拉伸和擠壓可能會對神經造成損害；②很難控制進入神經細胞的確切數量；③該模型僅限于對已經侵入神經的腫瘤細胞進行研究，而不能夠研究神經與位于原發腫瘤中的腫瘤細胞相互作用，缺乏評估PNI 早期階段的能力；④與胃腸道神經相比，使用坐骨神經的主要缺點是坐骨神經不是胰腺癌的轉移部位，神經纖維的組成和性質的不同可能影響神經的侵襲，但是胰腺神經很難獲得并且體積非常小，不允許這樣的研究。該模型具有較強的通用性，可以應用于各種PNI 研究，可以使用具有不同基因修飾或不同類型腫瘤細胞的小鼠來研究PNI 的細胞和分子機制。HUANG 等［15］在此模型的基礎上利用氧化鐵納米顆粒和磁共振成像建立了一種敏感、無創的神經侵犯監測方法，該方法在一定程度上克服了現有的體內PNI 評估方法的局限性，具有一定的應用價值。此外，通過對研究小鼠進行治療，此模型可以研究治療藥物對神經侵襲的影響。

2.3 雞胚絨毛膜尿囊膜（CAM）體內模型 SCHMITD等［16］使用CAM 在體模型評價頭頸部腫瘤神經周圍浸潤。該模型將大鼠DRG 和人頭頸部鱗狀癌細胞移植到雞胚絨毛上皮，用于評估腫瘤細胞在體內侵襲神經組織的能力。該模型可以通過熒光標記DRG 和腫瘤細胞，更加便于觀察，采用Image J6 圖像分析儀測量腫瘤細胞與DRG 的距離和腫瘤面積，并用t檢驗評估各組之間的差異；使用石蠟包埋的CAM 組織切片，對其進行免疫組織化學染色評估結締組織內的侵襲性。該模型的優點是可以評估PNI 以及腫瘤生長、轉移和血管生成，比坐骨神經注射腫瘤細胞的小鼠模型更加經濟。而該模型存在的局限性為：①在將腫瘤細胞移植到DRG 附近時的距離不好掌握，腫瘤細胞與DRG 之間的距離過近或過遠可能會損害腫瘤細胞和神經之間的分子相互作用。②如果胚胎年齡大于該方案中的規定年齡，胚胎運動可能會取代腫瘤細胞，因此一定要使用與受精后第10 天一致的雞胚進行細胞移植。③由于雞胚免疫系統在18 d 之前還沒有完全發育，因此，該模型不適用于評估免疫細胞在腫瘤發展中的作用。④可用于雞胚的試劑如抗體、細胞因子和引物比較有限。目前在體內實驗水平上，小鼠異種移植模型是用于評估藥物行為的最常見模型，由于嚙齒動物臨床前模型既昂貴又耗時，并引起倫理關注，使得雞絨毛尿囊膜試驗成為常用動物模型的有效替代方法，該模型也廣泛應用于血管生成作用的研究［17-18］。

綜上所述，腫瘤細胞與DRG、神經外植體、施萬細胞、PC-12 神經元細胞/50B11 神經元細胞共培養模型等PNI體外模型以及小鼠原位胰腺腫瘤的神經侵襲和轉移模型、將同基因胰腺癌細胞注射到坐骨神經中進行神經侵襲的活體小鼠模型、CAM 體內模型等PNI 體內模型已被應用于腫瘤學的研究中，在腫瘤轉移、侵襲及藥物治療等研究領域發揮作用。每個PNI 研究模型都有其不同的優勢和劣勢，建立合理的實驗模型對進一步研究惡性腫瘤PNI的機制及治療方案是十分必要的。