MicroRNA 在肺腺癌表皮生長因子受體—酪氨酸激酶抑制劑耐藥中的作用及其機制研究進展

程萬里，劉鑫 ，任文俊，2，汪俊其 ，張立人，王平

1 昆明醫科大學第二附屬醫院胸外科，昆明 650101；2 云南省第一人民醫院心臟大血管外科

肺癌是世界上癌癥相關死亡的主要疾?。?］。近年肺腺癌的發展日益嚴重，多數發現時已是中晚期［2］，失去手術根治機會。表皮生長因子受體（EGFR）是一種酪氨酸激酶受體，作為HER 家族受體中的一員，它是由具有酪氨酸激酶活性的C 端細胞內催化區域、N 端細胞外配體結合位點和疏水性跨膜結構域組成［3］。EGFR 激活突變在肺癌發生和細胞增殖過程中有非常重要的作用［4-5］，由于EGFR 突變的發生，酪氨酸激酶抑制劑（TKI）成為晚期肺腺癌患者治療主導藥物［6］，EGFR-TKI 也被批準為 EGFR突變患者的一線治療藥物［7］，治療效果雖好，但存在耐藥性［8］。因此，有必要探尋提高藥物敏感性的有效調節劑以及監測耐藥發生的生物標志物。

微小RNA（miRNA）是一類由內源基因編碼的短小非編碼RNA 分子，大部分miRNA 長度為19～22 個核苷酸［9］。有研究［10-13］表明，miRNA 可作為促癌或抑癌基因，靶向作用于耐藥、細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡相關基因，調控多種因子的表達，參與腫瘤的發展和耐藥。據報道，miRNA 對肺腺癌EGFR 信號通路以及相關細胞因子的正常表達有重要調節作用，特異性miRNA 的失調可能是癌細胞化療耐藥性產生的主要因素。上述這些研究均表明miRNA 參與肺腺癌耐藥的發展過程，因而，明確miRNA 在肺腺癌EGFR-TKI 耐藥中的具體作用，為探索EGFR-TKI 耐藥的克服、藥物敏感性的提升、耐藥發生的監測以及新型藥物開發提供了全新思路。肺腺癌EGFR-TKI 耐藥機制主要有EGFR 表達異常、EGFR 基因突變、酪氨酸激酶受體擴增、上皮間質轉化（EMT）等。近年，miRNA 在肺腺癌EGFRTKI 耐藥的不同機制中作用的研究已取得一定成果，現作以下綜述。

1 miRNA在EGFR表達異常致肺腺癌EGFR-TKI耐藥中的作用及其機制

靶向化療是晚期肺腺癌的關鍵治療，EGFR 的異常表達則嚴重影響EGFR-TKI 藥物的敏感性，成為肺腺癌患者預后的巨大障礙。有研究者用過表達miR-7 轉染肺腺癌細胞，發現與未轉染的癌細胞比較，高表達miR-7 的細胞存活率明顯下降，再通過Western blotting 法檢測發現EGFR 的表達受miR-7的負向調節，miR-7 下調導致EGFR-TKI 的敏感性降低從而產生耐藥性［14］。miR-7 的負向調節在化療耐藥中起到了重要作用，通過檢測miR-7 的表達可監測耐藥的發生，及時調整患者治療。有研究者發現，miR-608、miR-4513 以及 miR-1262 在 EGFR-TKI治療肺腺癌細胞（PC9 和H1299）時發揮不同作用，miR-608 和miR-1262 的表達顯著增強了EGFRTKI 在肺腺癌細胞中的抗增殖作用，而miR-4513的表達則明顯提升癌細胞的耐藥性，造成這種差異的主要因素是miRNA 等位基因單核苷酸多態性（SNP），miR-608 SNP rs4919510、miR-1262 SNP rs12740674 和 miR-4513 SNP rs2168518，通 過 介導miRNA 的表達，導致EGFR 通路相關因子表達失衡而出現上述情況15-16］。一項研究［17］表明，miRNA與腫瘤免疫微環境（TIME）也有著密切關系。利用病理學檢查EGFR-TKI 耐藥肺癌組織發現CD8 陽性T細胞浸潤水平明顯降低，體外實驗顯示miR-1的上調可抑制CD8陽性T細胞的遷移、浸潤水平，改變了TIME 的特征，促進了腫瘤EGFR-TKI 耐藥的發生和發展。表明miRNA 可通過調控TIME 特征進而影響化療藥物的敏感性，miRNA 抑制劑和TIME 特征預測可能為EGFR-TKI 耐藥的克服和監測提供了新策略。ZHANG 等［18］在研究肺腺癌中 NOTCH 信號與EGFR-TKI 耐藥關系時發現，NOTCH 成員中的NOTCH3 在肺腺癌EGFR-TKI 耐藥細胞株（HCC827 GR6）中上調，NOTCH3 又可調控下游膠原蛋白1A1（COL1A1）的表達，二者同時促進腫瘤細胞的增殖。miR-150 已被證實為NOTCH3 的轉錄后調控因子，miR-150 直接靶向調控NOTCH3 的表達，通過 miR-150/NOTCH3/COL1A1 軸 參 與 EGFR-TKI 耐藥。另外，在肺腺癌miR-630/YAP1/ERK 通路中，低表達的miR-630反饋性調節YAP1去靶向，并通過反饋通路中的ERK 因子使絲氨酸75 位點發生磷酸化，降低促凋亡蛋白Bad 的表達，導致EGFR-TKI 的抗腫瘤敏感性下降［19］。這些證據均表明miRNA 在EGFR異常致肺腺癌EGFR-TKI耐藥中起重要作用。

2 miRNA在EGFR基因突變致肺腺癌EGFR-TKI耐藥中的作用及其機制

據研究［20-21］報道，在接受EGFR-TKI 治療的肺腺癌患者中超過半數會出現二次突變。在一、二代EGFR-TKI 藥物治療中多數患者會出現T790M 的突變，原因是EGFR 基因20 外顯子第790 位點上的蘇氨酸（T）突變為甲硫氨酸（M），增加了催化區域與三磷酸腺苷（ATP）的親和力，因此ATP和EGFR-TKI之間形成競爭性結合關系，影響EGFR-TKI 的結合導致敏感性降低或消失。另外，第三代EGFR-TKI 藥物是通過第797 位點上的半胱氨酸殘基共價結合發揮抗腫瘤作用。由于二次突變，EGFR 797位半胱氨酸（C）被絲氨酸（S）取代，嚴重降低了EGFR-TKI 的結合率而出現耐藥。因此，肺腺癌患者在使用第三代藥物治療時所面臨的主要阻礙是EGFR C797S 突變［22-23］。一項研究［24］發現，具有 EGFR T790M 突變的兩組小鼠肺癌細胞：Ⅰ組EGFR-TKI 敏感兩株細胞（PC-9 和H3255），Ⅱ組EGFR-TKI 不敏感兩株細胞（（RPC-9 和H1975），用陽離子脂質體使 miR-7 的質粒表達后發現兩組癌細胞生長均被顯著抑制。此外，miR-7 的 3'- UTR 還可與 EGFR 的 mRNA 結合，降低EGFR 表達，對癌細胞的抑制作用進一步加強。說明miR-7對T790M 突變的耐藥有著顯著的克服作用。就EGFR T790M 突變的肺腺癌患者而言，開發miR-7相關藥物可能使其治療更具針對性。有研究［25］發現，miR-138-5p 在 EGFR-TKI 耐藥細胞株表達明顯下調，進一步在EGFR T790M 突變的肺腺癌細胞株中轉染過表達miR-138-5p，可恢復EGFR-TKI的治療敏感性，說明高表達水平的miR-138-5p 可能是克服EGFR T790M 突變致肺腺癌細胞株對EGFRTKI耐藥的關鍵因素。

3 miRNA 在酪氨酸激酶受體擴增致肺腺癌EG?FR-TKI耐藥中的作用及其機制

近年，在應用EGFR-TKI 治療的患者中，酪氨酸激酶受體基因擴增所導致的二次耐藥也扮演著重要角色。酪氨酸激酶受體是一種跨膜蛋白，具有自主磷酸化活性，胞外區與肝細胞生長因子（HGF）配體結合發生受體二聚化，誘導ErbB3 磷酸化、PI3K/Akt通路激活，使下游通路持續活化導致EGFR-TKI 的抑制作用失效。HGF 不僅促進酪氨酸激酶受體擴增，還可與其結合調節下游SAE2 和circRNA CCDC66 的表達，誘導肺腺癌耐藥［26-27］。另外有研究［28］發現，酪氨酸激酶受體擴增的同時部分EGFR T790M 也處于突變狀態，二者之間存在“合作關系”共同發揮耐藥作用。有研究者在治療酪氨酸激酶受體-TKI耐藥的過程中發現，miR-205/ERRFI1（ERRB受體反饋抑制因子1）軸是酪氨酸激酶受體-TKI 耐藥的新型中介。酪氨酸激酶受體-TKI 耐藥的維持需要EGFR 的活化。miR-205 可下調ERRFI1 的表達，下調的ERRFI1 又進一步導致EGFR 通路的活化，出現酪氨酸激酶受體-TKI 耐藥表型［29］。說明miR-205 對耐藥的發生起到了重要推動作用。有研究［30］表明，在 HGF 誘導的 EGFR-TKI 耐藥細胞系HCC827 和 PC-9 中，利用 miR-34a 聯合 EGFR-TKI 共同作用時，發現酪氨酸激酶受體靶點可被抑制，對HGF 介導的耐藥有抑制作用，并誘導腫瘤細胞凋亡。這表明miR-34a 在酪氨酸激酶受體突變中具有重要作用，miR-34a 聯合化療藥物可增加化療藥物的敏感性，提升肺腺癌患者的治療效果。

4 miRNA 在 EMT 致肺腺癌 EGFR-TKI 耐藥中的作用及其機制

EMT 表型改變是肺腺癌患者EGFR-TKI 耐藥的另一種重要表現。EMT 是腫瘤上皮組織向紡錘狀間葉組織轉化［31］，表現為上皮細胞的黏附性消退，間質成分表達增加。EMT 在肺腺癌耐藥中的機制雖未完全明確，但在EMT 過程中可通過檢測其相關蛋白增加或減少來提示腫瘤EMT 發生。研究［32］表明，在肺腺癌EMT 發生過程中EGFR-TKI耐藥患者組織中EMT 相關蛋白表達會有所變化，上皮細胞消退時連接蛋白表達量下調如E-鈣黏合蛋白，而間質蛋白表達增加如間質波形蛋白，這些蛋白的表達變化可能為腫瘤 EMT 發生提供線索。LI 等［33］研究發現，致癌基因miR-181b-5p 可靶向作用于E-鈣黏合蛋白使其表達下調，促進腫瘤的侵襲和轉移。同時，miR-181b-5p 通過上述靶向作用還可介導EMT 的發生。有研究者發現，一種神經內分泌因子VGF 在肺腺癌細胞亞群中高表達，VGF 表達使EGFR-TKI 的敏感性下降而引起耐藥，當沉默VGF 時EGFR-TKI 的敏感性又重新恢復，VGF 還可誘導EMT，從而增加肺腺癌細胞的遷移和侵襲行為［34］。另外，有研究者發現，3%～10%的EGFR 突變肺腺癌患者在接受EGFR-TKI 治療后會轉化為小細胞肺癌（SCLC），肺腺癌轉化為SCLC 的機制未完全闡明，但已證實RB1、TP53以及PIK3CA 突變占主導作用［35］。有研究者研究miR-92a 時發現，miR-92a 具有促進癌細胞增殖、侵襲和轉移功能，此功能是耐藥發生的主要因素。miR-92a 通過抑制同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）的表達，使 PTEN 失去作為 PI3K/AKT 通路負調控因子作用，激活PI3K/AKT，誘導EMT 發生，引起肺腺癌細胞EGFR-TKI 耐藥［36］。這些研究均說明miRNA 的調控在EMT 致肺腺癌EGFR-TKI 耐藥中的重要作用，這也為提高肺腺癌患者的療效和耐藥監測提供了新的可能性。

5 miRNA 在其他原因致肺腺癌EGFR-TKI 耐藥中的作用及其機制

PTEN 為一抑癌基因的蛋白質產物，可抑制下游PI3K/AKT 通路激活，促進腫瘤細胞凋亡。當PTEN 發生甲基化、等位基因缺失等突變時，下游PI3K/AKT 通路磷酸化水平升高，則失去抑癌作用，導致肺腺癌 EGFR-TKI 發生耐藥［37］。研究顯示，癌基因miR-21 表達量越高，EGFR-TKI 耐藥現象越明顯，二者之間呈正相關。進一步研究［38］表明，過表達的miR-21 可靶向抑制PTEN 的表達，導致下游PI3K/AKT 信號通路激活，誘導肺腺癌EGFR-TKI 耐藥的發生。另一項研究［39］發現，miR-214在EGFR-TKI耐藥細胞系（HCC827/GR）中顯著上調，通過雙熒光素酶報告系統驗證了PTEN 是miR-214的直接靶點，高表達的miR-214 直接靶向作用PTEN，使PTEN/PI3K/AKT信號通路失調而介導EGFR-TKI耐藥。這些證據表明miRNA 的表達水平可影響PTEN 的抑癌作用，導致相關下游通路激活而發生耐藥?；蛟S開發有效的miR-21和miR-214抑制劑藥物，將大幅度提升PTEN突變肺癌患者EGFR-TKI的療效。

胰島素樣生長因子1 受體（IGF-1R）激活突變后，可通過激活PI3K/AKT 信號通路介導肺腺癌腫瘤細胞增殖、抑制細胞凋亡以及增強腫瘤細胞的抗藥 性［40］。MA 等［41］將 miR-497mimic 轉 染 至 EGFRTKI 耐藥的人肺腺癌細胞系（A549/GR）中，發現IGF-1R 和磷酸化AKT1表達水平降低，EGFR-TKI的抗癌效果顯著提高。說明高表達的miR-497 可抑制IGF-1R 蛋白的表達，阻斷通路下游的AKT1 激活。提示通過提高miR-497 的表達水平可逆轉肺腺癌IGRF-1R 突變患者的耐藥以及提升EGFR-TKI 敏感性。另一項研究［42］表明，miR-200b可抑制IGF-1R的表達，降低PI3K/AKT 和MAPK 信號通路的活性，增強EGFR-TKI 的抑制腫瘤細胞增殖和促進凋亡作用?？梢?，在其他原因導致的EGFR-TKI 耐藥中，miRNA 的表達也發揮出至關重要的調控作用，也為提高EGFR-TKI治療療效提供了思路。

綜上所述，miRNA 可調控多種肺腺癌EGFR -TKI 耐藥途徑。miRNA 在肺腺癌EGFR-TKI 耐藥機制中通過自身的表達水平，打破EGFR-TKI 耐藥機制平衡，因此了解其在獲得性耐藥中潛在的分子機制，是提升EGFR-TKI 療效的關鍵。 miRNA 本身可成為藥物開發的靶點，通過miRNA 干擾方法調節體內miRNA 的表達量可對EGFR-TKI耐藥關鍵因子如EGFR、酪氨酸激酶受體、HGF、EMT、PTEN、IGF-1 等以及信號轉導通路進行調控，達到逆轉腫瘤細胞EGFR-TKI 抗藥性目的；另外，通過檢測目標miRNA在體內的表達變化，使監測肺腺癌EGFR-TKI 耐藥發生成為可能。目前miRNA 在肺腺癌EGFR-TKI耐藥中的研究仍處于起步階段，miRNA 在肺腺癌耐藥中的具體機制還未完全闡明，依然面臨著諸多挑戰。作為化療藥物有效的調節劑和監測耐藥發生的生物標志物，miRNA 的可行性、安全性、有效性以及低成本高效益還均需大量的研究去驗證。