蛇菰多糖對大鼠乙酸型胃潰瘍的治療作用及機制

夏德堯，黃晟哲，趙依如，王江華，牟俊彥，趙方毓，王鳳杰，陳顯兵

(湖北民族大學1.附屬民大醫院病理科、2.醫學部,湖北 恩施 445000)

胃潰瘍(gastric ulcer，GU)是消化系統的常見疾病之一，是一種深達胃黏膜層甚至黏膜肌層的壞死性缺損，臨床上以周期性、節律性的上腹部疼痛為主要表現，易反復發作，遷延不愈而成慢性病，嚴重者可出現便血、胃出血甚至胃穿孔等癥狀，可能導致死亡[1]。由于人們飲食和生活習慣的改變，GU的發病率逐年上升，且有年輕化趨勢。GU發病受到多種因素影響，一般認為，攻擊因子與防御因子的失衡是潰瘍發生的主要原因，GU的損傷修復同樣也是一個涉及多種細胞及細胞因子的復雜過程。研究發現，氧化應激、炎癥反應及表皮的分化和再生對GU的發生和發展都起重要作用[2]。因此，通過抑制氧化應激和炎癥反應，促進潰瘍區域表皮的增生分化，從而減輕胃黏膜損傷，加快GU愈合具有重要意義。

筒鞘蛇菰(BalanophorainvolucrataHook.f.)是土家名貴藥材，又名文王一支筆、借母還胎或雞心七等，具有清熱解毒、涼血止血、固腎澀精等功效，湖北恩施民間用以治療消化性潰瘍、肝炎、外傷出血和醉酒等病癥。研究發現，筒鞘蛇菰含多糖、黃酮和三萜類等活性成分，具有抗炎鎮痛、抗氧化和抗癌等多種藥理學作用[3-4]。蛇菰多糖(balanophorapolysaccharide，BPS)是筒鞘蛇菰的有效成分之一，前期研究證實，BPS可通過抗氧化等機制降低糖尿病大鼠血糖，改善脂肪代謝異常[5]，但對于GU的療效觀察和作用機制研究未見報道。本研究采用乙酸燒灼法制備GU模型，探究BPS對GU的療效及可能的作用機制，為GU的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器BPS由湖北民族大學中藥學實驗中心自制。藥材全草采自湖北恩施，經湖北民族大學中藥學實驗中心李厚聰博士鑒定為蛇菰科蛇菰屬植物筒鞘蛇菰。新鮮藥材洗凈后60 ℃烘干，搗成粗粉后稱取500 g，以8倍體積的雙蒸水浸泡4 h后，加熱煮沸2 h，以紗布過濾保存濾液，藥渣再加6倍體積水煮沸1 h后留存濾液，合并2次濾液，再加熱減壓濃縮至1 L，冷卻后加入無水乙醇使乙醇體積分數達75%，4 ℃靜置過夜；用紗布過濾收集沉淀，并用無水乙醇沖洗3次，于50 ℃烘箱干燥沉淀物，得蛇菰粗多糖。采用苯酚-硫酸法測定其中多糖含量為61.3%。

冰乙酸分析純(天津市福晨化學試劑廠，批號：20150202)，奧美拉唑腸溶片(Omeprazole Enteric-coated Tablets, OME，批號：2004022，青島雙鯨藥業股份有限公司)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD，貨號：A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde, MDA，貨號：A003-1-2)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX,貨號：A005-1-2)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，即用型免疫組織化試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司，貨號：KIT-9710)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α，貨號：PT516)和白細胞介素6(interleukin-6, IL-6，貨號：PI328)ELISA試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，表皮生生長因子(epidermal growth factor, EGF，貨號：A00378-1)單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR，貨號：AF1330)單克隆抗體和β-actin單克隆抗體(貨號：AF5003)(上海碧云天生物技術有限公司)，生物素標記的山羊抗兔IgG抗體(武漢科瑞生物技術有限公司，貨號：137093)，其他蛋白免疫印跡相關試劑(上海碧云天生物技術有限公司)。

冰凍切片機(德國Leica Biosystems Nussloch GmbH公司)，熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，全波長酶標儀(美國Thermo公司)，Western blot電泳及轉膜系統(美國Bio-Rad公司)，Tanon-5200全自動化學發光成像系統(上海天能科技公司)。

1.2 動物、分組和造模60只雄性SD大鼠，8周齡，體質量(200±20) g，購自湖北省實驗動物中心,許可證號SCXK(鄂)2015-0018，分籠飼養，自然光照周期，維持室溫24 ℃。實驗動物操作均符合動物倫理委員會制定的操作標準，接受湖北民族大學動物倫理委員會的監督與檢查。

大鼠適應性喂養1周后，隨機分為假手術組(Sham)、GU模型組(GU)、OME陽性組(OME)、BPS低、中、高劑量治療組(BPS-L，BPS-M，BPS-H)，每組10只。除Sham組外，各組均采用Okabe[6]的乙酸燒灼法進行胃潰瘍模型制備。具體操作：使用10%水合氯醛3.5 mL·kg-1將大鼠麻醉后，在左上腹區域備皮，消毒后縱向做一1.5 cm左右切口，使用無齒鑷游離胃體并從切口拉出，使用32 G一次性注射針頭將50%乙酸溶液注射至胃漿膜層下，每只0.05 mL，選取相同部位注射，Sham組使用等體積生理鹽水注射，確認胃體無出血后，用生理鹽水沖洗胃體，用大網膜覆蓋注射區，還納胃體入腹，分層縫合，外涂馬應龍麝香痔瘡膏，操作全程注意無菌。

1.3 樣本采集造模后1 d開始進行灌胃，OME組每日使用OME溶液3.6 mg·kg-1灌胃，BPS-L、BPS-M和BPS-H組每天使用BPS溶液100、200和400 mg·kg-1灌胃，Sham組和GU組使用等體積雙蒸水灌胃，連續10 d。末次給藥后禁食不禁水24 h，使用10%水合氯醛麻醉大鼠，打開腹腔，將胃體從賁門和幽門離斷取出。將胃體延胃大彎剪開，使用生理鹽水沖洗內容物，暴露潰瘍病灶，帶刻度拍照后，以潰瘍灶為中心取包括周圍0.5 cm的胃組織，將組織分為兩部分，一部分使用中性甲醛固定，一部分于-80 ℃凍存備用。

1.4 指標檢測

1.4.1各組大鼠潰瘍面積和潰瘍抑制率計算 根據帶刻度拍攝的圖片，測量潰瘍的最大直徑(d1)和最大寬徑(d2)，按公式進行計算：

潰瘍面積/cm2=π× d1/2×d2/2；

潰瘍抑制率/%= (1-給藥組潰瘍面積/模型組潰瘍面積)×100% .

1.4.2HE染色觀察各組大鼠胃潰瘍組織病理形態變化 取中性甲醛固定24 h后的組織樣本，進行修塊、脫水、透明，石蠟包埋，4 μm切片，60 ℃烤片2 h，全自動染色機進行HE染色，中性樹脂封片，掃描圖片觀察。

1.4.3酶法檢測各組大鼠胃組織中SOD活力、MDA含量和GSH-PX活力 取適量凍存的組織樣本，加入含苯甲基磺酰氟的細胞裂解液制備組織勻漿，提取總蛋白并測定蛋白濃度。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，測定組織勻漿中各指標情況。

1.4.4ELISA檢測各組大鼠胃組織中TNF-α和IL-6蛋白含量 取適量凍存組織樣本，同前法提取總蛋白并測定濃度。按照試劑盒說明操作，使用預包被板操作，加樣后封板室溫孵育2 h，洗板5次，每次30 s；加入生物素化抗體，封板室溫孵育1 h，洗板5次，每次30 s；加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin，封板室溫避光孵育20 min，洗板5次，每次30 s；加入顯色劑TMB溶液，封板室溫避光孵育20 min；加入終止液，混勻后立即使用酶標儀測量450 nm處吸光度。根據試劑盒所提供的標準品制作標準曲線，計算樣本蛋白含量。

1.4.5免疫組化法測定EGF和EGFR蛋白在各組大鼠胃組織中的表達定位 胃組織厚4 μm石蠟切片后，在60 ℃攤片機烤片2 h，二甲苯脫蠟3次，每次3 min；無水乙醇浸泡3次，每次5 min，純水沖洗1 min，置于EDTA修復液于高壓鍋高壓修復2 min，流水冷卻后用PBS溶液沖洗3次，除去PBS，按照免疫組化試劑盒說明，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，反應10 min；PBS溶液沖洗3次，滴加非特異染色阻斷劑，反應10 min；除去殘余試劑，滴加稀釋好的EGF(1 ∶200)和EGFR(1 ∶100)抗體，孵育1 h；PBS溶液沖洗3次，除去PBS，滴加生物素標記的山羊抗兔/小鼠IgG聚合物，反應10 min；PBS溶液沖洗3次，除去PBS，滴加辣根過氧化物酶，反應10 min；PBS溶液沖洗3次，除去PBS，滴加DAB顯色液避光顯色10 min；流水沖洗1 min，置于蘇木精染色液1 min，流水沖洗，鹽酸酒精分化15 s，流水沖洗，返藍30 s，流水沖洗，無水乙醇浸3 s，冷風風干水痕，中性樹脂封片，掃描圖片觀察。

1.4.6Western blot檢測各組大鼠胃組織中EGF和EGFR蛋白的相對表達量 取凍存組織適量，提取總蛋白，測定蛋白濃度，根據樣本中最低濃度標準，使用凝膠電泳上樣緩沖液將蛋白樣品稀釋至同一濃度。經SDS-PAGE電泳后轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，EGF(1 ∶2 000)和EGFR(1 ∶2 000)一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min;生物素標記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，ECL發光檢測，凝膠成像系統顯影并分析，β-actin作為內參蛋白。

2 結果

2.1 BPS減輕了GU大鼠胃黏膜組織病理損傷Fig 1結果顯示，Sham組大鼠胃黏膜無明顯缺損，皺襞清晰，GU組、OME組和BPS各治療組大鼠胃黏膜均出現不同程度缺損，形成橢圓或近似圓形潰瘍病灶，潰瘍區及周圍皺襞消失。經過測量計算發現，與GU組比較，BPS-L、BPS-M、BPS-H和OME組潰瘍面積均明顯減小(P<0.01)，潰瘍抑制率分別達45.45%、65.15%、57.58%、56.06%(Tab 1)，BPS-M和BPS-H組潰瘍抑制率比OME組高，但差異無統計學意義。為進一步觀察胃黏膜損傷情況，我們對胃黏膜組織進行了HE染色，結果如Fig 1B所示，Sham組大鼠胃黏膜無明顯缺損，細胞排列整齊，無炎性細胞浸潤；GU組大鼠胃黏膜缺失明顯，結構破壞嚴重，潰瘍損傷深達肌層，淋巴細胞浸潤明顯；BPS-L組大鼠胃黏膜缺失，結構破壞明顯，可見大量淋巴細胞浸潤，BPS-M和BPS-H組大鼠潰瘍周圍胃黏膜形態結構趨于正常，潰瘍面黏膜缺損，損傷部位見新生肉芽組織，仍可見少量淋巴細胞浸潤，OME組大鼠潰瘍周圍黏膜形態趨于正常，見少量淋巴細胞浸潤。以上結果表明，BPS可以減輕大鼠胃黏膜損傷，對乙酸所致大鼠GU具有較好的治療作用。

Fig 1 Effect of Balanophora polysaccharide(BPS) on gastric tissue pathological morphology in rats with gastric ulcer (GU)(HE×400)

Tab 1 Effect of BPS on ulcer area and ulcer inhibition rate in rats with

2.2 BPS增加了GU大鼠胃組織中SOD和GSH-PX活力，降低了MDA含量氧化應激損傷是胃黏膜損傷的重要因素，SOD、MDA和GSH-PX能較全面的反映氧化應激水平。結果如Tab 2所示，與Sham組比較，GU組大鼠胃組織中SOD和GSH-PX活力明顯降低(P<0.01或P<0.05)，MDA含量增加(P<0.01)；經藥物干預后，各指標均有不同程度逆轉，與GU組比較，BPS-L、BPS-M和BPS-H組SOD活力分別增加50.51%、71.19%、79.49%(均P<0.01)，MDA含量分別減少8.33%、15.28%、11.11%，但均無統計學差異，BPS-H組GSH-PX活力增加27.66%(P<0.05)，OME組SOD活力增加113.29%(P<0.01)，MDA含量減少38.89%(P<0.01)，GSH-PX活力增加25.36%(P<0.05)，BPS-H組GSH-PX活力增加率高于OME組，但無統計學差異。以上結果表明，BPS治療大鼠乙酸型胃潰瘍的作用機制可能與抑制氧化應激相關。

Tab 2 Effect of BPS on SOD activity, MDA content and GSH-PX activity in gastric tissues of rats with GU

2.3 BPS降低了GU大鼠胃組織中TNF-α和IL-6蛋白含量氧自由基不僅能引起氧化應激損傷，而且與炎性損傷也密切相關，炎癥反應是GU病理過程中的重要環節。Fig 2結果顯示，與Sham組比較，GU組大鼠胃組織內TNF-α和IL-6蛋白含量明顯增加(均P<0.01)；藥物干預后的各組大鼠胃組織中TNF-α和IL-6蛋白含量明顯降低，與GU組比較，BPS-L、BPS-M和OME組TNF-α蛋白含量分別降低41.23%、59.92%、71.27%(P<0.05或P<0.01)，BPS-L、BPS-M、BPS-H和OME組IL-6含量分別降低47.69%、63.72%、63.53%、77.01%(均P<0.01)。以上結果表明，BPS治療大鼠乙酸型胃潰瘍的作用機制可能與降低TNF-α和IL-6蛋白含量，減輕炎癥損傷有關。

Fig 2 Effect of BPS on content of TNF-α and IL-6 protein in gastric tissues of rats with

2.4 BPS上調了GU大鼠胃組織中EGF和EGFR蛋白表達水平EGF和EGFR是重要的胃黏膜防御因子，在胃黏膜的修復過程中起著重要的作用。為了解EGF和EGFR在胃黏膜中的表達部位，我們進行了免疫組化染色，結果如Fig 3A所示，EGF主要在細胞質表達，陽性表達為棕色，在胃黏膜和潰瘍基底部均呈弱陽性表達；EGFR在細胞膜和細胞質中均有表達，陽性表達呈棕色，在胃黏膜、潰瘍基底部以及潰瘍滲出物中均呈強陽性表達。為進一步評估EGF和EGFR的表達水平，我們進行了蛋白免疫印跡檢測，結果如Fig 3B、C、D所示，與Sham組比較，GU組大鼠胃組織中EGF和EGFR蛋白表達水平有所升高，分別增加7.36%、66.98%，但無統計學差異；經BPS治療后，各組EGF和EGFR蛋白表達水平進一步升高，與GU組比較，BPS-L、BPS-M、BPS-H和OME組EGF表達分別升高124.47%、99.50%、103.32%、105.75%(P<0.05或P<0.01)，BPS-H組EGFR表達升高91.37%(P<0.05)，BPS-L、BPS-M和OME組EGFR表達分別升高35.73%、61.20%、53.74%，差異均無統計學意義；BPS-L組EGF表達高于OME組，BPS-M和BPS-H組EGFR表達高于OME組，但差異均無統計學意義。以上結果表明，BPS治療大鼠乙酸型胃潰瘍的作用機制可能與增加胃黏膜中EGF和EGFR蛋白表達，促進黏膜修復有關。

3 討論

GU是消化系統常見疾病之一，以胃黏膜壞死性缺損為主要病理表現，而胃黏膜的損傷修復是一個非常復雜的過程，受到多種細胞因子的影響。研究發現，胃黏膜氧化應激、炎癥刺激、表皮細胞再生和血管再生等，都會影響GU的發生、發展和愈合[7]。本研究通過對GU大鼠胃組織的病理觀察、氧化和炎癥損傷相關指標檢測以及EGF及其受體EGFR的檢測，對BPS治療大鼠GU的作用機制進行了分析探討。

在GU的發生發展過程中，氧化應激和炎癥反應都是重要的攻擊因素。在乙酸刺激下，胃黏膜氧化和抗氧化水平失衡，產生氧化應激反應，氧化應激產生的活性氧(ROS)可以直接或間接地損傷細胞功能，導致胃黏膜屏障被破壞，胃黏膜修復障礙，導致GU的發生[8]。MDA是一種脂質過氧化產物，具有細胞毒性，其含量反映了胃黏膜氧化損傷程度，而SOD和GSH-PX屬于抗氧化酶系統，可以反映ROS的清除力，保護細胞不受過氧化物損害，體現胃黏膜的抗氧化水平。炎癥反應是GU的特征之一，TNF-α是炎癥過程中巨噬細胞分泌的主要促炎因子，可以促進其他促炎因子如IL-1β、IL-6等的釋放，誘導中性粒細胞聚集，造成局部炎癥反應，破壞胃內保護屏障而導致潰瘍形成或加劇[9]。TNF-α和ROS也有著復雜的聯系，TNF-α可以誘導ROS的產生，加劇氧化應激反應，而ROS又可以進一步增強TNF-α的水平，加重炎癥反應，加劇胃黏膜損傷程度[10]。本研究結果顯示，GU大鼠胃組織潰瘍損傷明顯，抗氧化因子SOD和GSH-PX的活力降低，而攻擊因子MDA、TNF-α和IL-6的含量升高，提示GU大鼠胃組織出現氧化損傷和炎癥反應；經BPS治療干預后，SOD和GSH-PX的活力明顯升高，MDA、TNF-α和IL-6含量降低，提示BPS可以提高胃黏膜抗氧化水平，減少促炎因子的異常釋放，減輕氧化損傷和炎癥刺激，從而減輕胃黏膜損傷。

Fig 3 Effect of BPS on expression of EGF and EGFR proteins in gastric tissues of GU rats

EGF是一種重要的生物活性肽，是胃防御因子的重要成員之一，該因子能夠抑制胃酸和胃蛋白分泌，改善胃黏膜血流，保護胃黏膜免受損傷，加速潰瘍的愈合[11]。研究表明，EGF在正常胃黏膜中少量表達，而當GU發生時，EGF表達降低，但隨著潰瘍的愈合呈不斷升高趨勢。EGF的生物活性需與其受體EGFR結合后發揮作用，EGFR是一種跨膜糖蛋白，EGF與之結合后可以形成二聚體，促進黏膜的修復，并減少胃酸分泌，對胃潰瘍的愈合有著非常重要的意義。本研究結果顯示，EGF和EGFR生理情況下主要在胃黏膜中表達，當GU發生時，EGF和EGFR在受損的胃黏膜和潰瘍基底部有明顯表達；相對定量結果顯示，GU大鼠胃組織中EGF和EGFR表達增加，而BPS治療后，EGF和EGFR表達進一步增加，表明在GU發生發展的過程中，胃防御因子啟動自我修復機制，EGF和EGFR分泌增加，促進潰瘍修復，而經BPS治療后，EGF和EGFR蛋白分泌水平進一步增加，增強了胃黏膜的修復水平，加速潰瘍的愈合。

本研究選用OME作為陽性對照藥物，實驗結果可以發現，BPS-M和BPS-H組對GU大鼠的潰瘍抑制率比OME組高，但在作用機制上，BPS在抑制氧化應激和炎癥損傷方面作用不及OME，在調控生長因子促進胃黏膜修復方面也與OME沒有明顯差異，BPS與OME在潰瘍抑制率方面的比較并無統計學意義，因此推測是樣本量較小，統計誤差造成上述矛盾現象。BPS與OME的療效及作用機制比較，還需要進一步的大樣本研究才能得以確定。另外，從結果中可以看出，BPS的調節作用無明顯劑量依賴性，尤其在對炎癥因子TNF-α的調節方面，BPS-H組的作用不及BPS-L和BPS-M組，對IL-6的影響也不及BPS-M組，推測高劑量的BPS并不能更加有效的抑制炎癥損傷，甚至會減弱抑炎作用，不同濃度的BPS在GU的治療過程中所帶來的不同影響，還需要進行更加嚴謹的藥理學實驗加以驗證。

綜上述，BPS對大鼠GU具有較好的治療作用，可以促進潰瘍的愈合，其作用機制可能與抑制氧化應激，抑制炎癥刺激，促進胃黏膜再生修復有關，為BPS治療GU的臨床應用提供了一定的理論依據。