環狀RNA在肝癌耐藥中的作用及機制研究進展

黃國林，藍曉步，秦艷娥，黎 驪，陽 潔

(1. 廣西醫科大學第五附屬醫院，南寧市第一人民醫院藥學部，廣西 南寧 530022；2.廣西中醫藥研究院，廣西 南寧 530022；3. 廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021)

1 肝癌簡介

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，約75%～85%為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。2020年全球肝癌新發病例90.57萬例，死亡病例83.02萬例，在惡性腫瘤發生率和腫瘤致死率中分別位居第六位和第三位[1]。我國是肝癌發病率和死亡率最高的國家之一，在全球每年新增和死亡的HCC患者中有50%以上發生在我國，在我國常見惡性腫瘤發生率和腫瘤致死率中分別位居第五位和第二位[1]。乙型或丙型肝炎病毒感染、長期酗酒、非酒精脂肪性肝炎、食用黃曲霉毒素污染的食物、血吸蟲病等多種因素引起的肝硬化以及有肝癌家族史的人群是肝癌的高危人群。目前，HCC治療方法包括肝切除術、肝移植術、局部消融、經動脈化療栓塞(TACE)、放射治療、化療、靶向治療以及免疫治療等，中醫中藥治療、生物治療也有應用。其中，手術切除是治療早期肝癌的首選辦法，也是最有效的方法。HCC起病隱匿、進展迅速，多數患者確診時已達局部晚期或發生遠處轉移，難以手術且對傳統的放化療高度耐受，平均5年生存率低于10%[2]。目前，中晚期肝癌的主要治療方法包括化療、靶向治療以及免疫治療，但長期用藥后往往都會產生耐藥，耐藥已經成為肝癌治療亟待解決的大問題。因此，研究肝癌耐藥產生的分子機制至關重要，近3年來，已有較多研究發現環狀RNA(circRNAs)的異常表達與肝癌耐藥密切相關(Tab 1)。

2 CircRNAs簡介

CircRNAs是一類不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾巴，并以共價鍵形成環形結構的新型非編碼RNA。根據其形成機制不同，circRNAs分為以下4類：外顯子circRNAs ( exonic circRNAs )、內含子circRNAs ( ciRNAs )、外顯子-內含子circRNAs ( ElciRNAs)和tRNA內含子circRNAs ( TricRNA )[3]。CircRNAs一開始被認為是錯誤剪接的副產物或剪接中間體。然而，隨著RNA測序技術的發展和生物信息學軟件的改進，在各種生物體中發現了越來越多不同的circRNAs，其形成機理和生物學功能逐漸顯現出來。越來越多的證據表明，circRNAs在多種腫瘤耐藥中發揮重要作用，包括肝癌[4]、肺癌[5]、乳腺癌[6]等。CircRNAs的作用方式主要包括[7]：(1)吸附miRNA，circRNAs通過吸附miRNA，阻斷miRNA和其靶基因相互結合，因而在轉錄調控中產生重要的影響；(2)與蛋白結合，circRNAs可作為蛋白質海綿，起到抑制蛋白質功能的作用；(3)編碼多肽，有些細胞質中的circRNAs可以翻譯多肽，具有翻譯功能的circRNAs分子具有內部核糖體進入位點元件或原核核糖體結合位點；(4)影響宿主基因的轉錄調控，定位于細胞核中的 circRNAs可能具有調控其宿主基因轉錄的功能。

3 CircRNAs與肝癌的關系

CircRNsAs在肝癌的診斷、治療、進展、預后和耐藥中發揮著重要作用。Wu等[8]研究發現，與慢性肝炎或健康對照組人群樣本相比，HBV相關HCC患者樣本中的circ_0009582，circ_0037120和circ_0140117表達顯著增加，3種circRNAs和AFP的組合可用于預測HCC伴HBV感染的發生。Chen等[9]發現，circ_0003418在HCC組織和細胞系中的表達水平下調，并且與HCC患者的腫瘤大小，TNM分期及HBsAg水平相關，敲低circ_0003418表達則促進HCC細胞的增殖，遷移和侵襲。Zhou等[10]發現，CircRNA_101237在HCC患者的腫瘤組織和血清中的表達分別高于癌旁組織和健康對照組的血清，并且與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期密切相關，血清circRNA_101237水平是肝細胞癌患者生存預后的獨立預測指標。Xu等[11]研究發現，circRNA-SORE在索拉非尼耐藥的HCC細胞中上調，敲低circRNA-SORE后大大增加了索拉非尼的細胞殺傷能力。Huang等[12]研究發現，circUBE2D2在HCC組織和細胞中上調，與HCC患者的預后不良呈正相關，circUBE2D2過表達致使HCC細胞索拉非尼耐藥，而敲低circUBE2D2則增加HCC細胞索拉非尼敏感性。

4 CircRNAs在肝癌耐藥中的作用及機制研究進展

4.1 CircRNAs在肝癌化療耐藥中的作用及機制的研究進展TACE治療及化療是肝癌的重要治療手段。TACE常用的化療藥物有蒽環類(如多柔比星、表柔比星、伊達比星)、鉑類、5-氟尿嘧啶、雷替曲塞等[13]。另外，以奧沙利鉑為主的系統化療被中國臨床腫瘤學會(CSCO)推薦為晚期HCC的一線治療方案。肝癌患者前期化療可能效果良好，但長期化療往往出現耐藥。近年來，多項研究表明，circRNAs在肝癌化療耐藥中扮演重要角色。

Tab 1 CircRNAs in therapeutic resistance of liver cancer

4.1.1CircRNAs在肝癌順鉑耐藥中的作用及機制的研究進展 為了研究circRNAs在HCC順鉑耐藥中的作用，Li等[14]通過circRNAs微陣列分析了5對順鉑耐藥和順鉑敏感的HCC組織，共檢測到了9 857個circRNAs，其中968個circRNAs的表達存在顯著異常；與順鉑敏感的HCC組織相比，順鉑耐藥HCC組織中有538個circRNAs顯著上調，430個circRNAs顯著下調；之后該團隊選擇上調最顯著的5個和下調最顯著5個circRNAs進行繼續研究，發現circARNT2的上調與HCC順鉑耐藥密切相關，其機制是circARNT2可作為miR-155-5p的海綿，在細胞內通過吸附miR-155-5p進而上調PDK1表達，抑制HCC細胞自噬，從而促使HCC細胞對順鉑產生耐藥。同樣的，Luo等[15]也通過circRNAs微陣列分析了4對順鉑耐藥和順鉑敏感HCC組織，發現circRNA_101505在順鉑耐藥HCC組織表達顯著下調，機制可能與circRNA_101505通過靶向miR-103下調NOR1，進而使HCC細胞對順鉑耐藥有關。Guan等[16]發現，敲低HCC細胞中的circRNA_102272降低了HCC細胞順鉑IC50，提示circRNA_102272與HCC細胞耐藥密切相關；進一步的機制研究表明，circRNA_102272通過吸附miR-326，解除miR-326對RUNX2的抑制，從而使RUNX2表達上調，最終使HCC細胞對順鉑耐藥。

4.1.2CircRNAs在肝癌奧沙利鉑耐藥中的作用及機制的研究進展 Li等[17]采用circRNAs微陣列對3對HCC患者的癌組織和癌旁組織進行分析發現，與正常組織相比，circFBXO11在HCC組織中的表達明顯上調，且與預后不良有關；體外實驗也表明，circFBXO11在HCC細胞的表達顯著高于正常細胞，在奧沙利鉑耐藥HCC細胞(HepG2/OXA)的表達顯著高于其親本細胞HepG2；進一步的機制研究發現，circFBXO11可以通過吸附miR-605促進FOXO3表達，FOXO3可進一步上調ABCB1，從而促使HCC細胞對奧沙利鉑耐藥。

4.1.3CircRNAs在肝癌多柔比星耐藥中的作用及機制的研究進展 Li等[18]為了探索circ_0003998對HCC多柔比星耐藥的影響，對55例配對HCC癌組織和癌旁組織進行了研究，結果發現circ_0003998在HCC癌組織顯著上調，特別是在多柔比星耐藥HCC組織中上調更顯著。深入研究后發現，Circ_0003998可以通過吸附miR-218-5p上調EIF5A2促使HCC細胞對多柔比星耐藥。另外，Huang等[19]通過研究25例HCC癌組織發現，circFOXO3在多柔比星耐藥HCC組織中表達顯著高于多柔比星敏感HCC組織，體外實驗證明circFOXO3可通過調控miR-199a-5p上調ABCC1來誘導HCC多柔比星耐藥。

4.2 CircRNAs在肝癌靶向治療耐藥中的作用及機制的研究進展目前用于治療肝癌的小分子靶向藥物有索拉非尼、侖伐替尼、多納非尼、瑞戈非尼、阿帕替尼、卡博替尼，其中索拉非尼、侖伐替尼、多納非尼為晚期HCC一線治療藥物，瑞戈非尼、阿帕替尼、卡博替尼為晚期HCC二線治療藥物。肝癌靶向治療同樣面臨耐藥的問題，且耐藥具體機制尚不明確。

4.2.1CircRNAs在肝癌索拉非尼耐藥中的作用及機制的研究進展 Yang等[20]通過circRNAs微陣列分析5對索拉非尼敏感的HepG2細胞和索拉非尼耐藥的SR-HepG2細胞中circRNAs的表達，鑒定出748個差異表達的circRNAs；隨后敲低索拉非尼耐藥HCC細胞circFN1的表達，發現敲低后其對索拉非尼的敏感性顯著增加，機制研究揭示其與circFN1通過內源性海綿樣作用吸附miR-1205促進E2F1表達，進而促使HCC對索拉非尼耐藥有關。Weng等[21]通過比較索拉非尼耐藥細胞和敏感細胞之間的circRNAs譜，鑒定出4個異常表達的circRNAs，其中敲低circFOXM1逆轉了索拉非尼耐藥細胞SR-HepG2和SR-Huh7的耐藥性，其機制與circFOXM1吸附miR-1324上調MECP2表達有關。Dong等[22]發現，circMEMO1在HCC樣本中顯著下調，并且與患者的總生存期和無病生存期密切相關；敲低HCC細胞circMEMO1可減弱索拉非尼對其的生長抑制作用，而過表達circMEMO1可增強索拉非尼誘導的生長抑制；circMEMO1及其下游靶標miR-106b-5p可調節HCC細胞對索拉非尼治療的敏感性。

4.2.2CircRNAs在肝癌侖伐替尼耐藥中的作用及機制的研究進展 侖伐替尼是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制成纖維細胞生長因子受體1-4、血管內皮生長因子受體1-3、血小板衍生生長因子受體α、RET和KIT而起抗腫瘤活性。然而，原發性和獲得性侖伐替尼耐藥嚴重限制了其治療療效。Zhang等[23]研究發現，circMED27在HCC血清和組織中上調，并且與患者預后不良呈正相關，circMED27高表達組HCC患者的無進展生存時間明顯低于circMED27低表達組；此外敲低HCC細胞circMED27可顯著提高其對樂伐替尼的敏度性，circMED27能夠作為ceRNA海綿吸附miR-655-3p上調泛素特異性肽酶28(USP28)的表達，從而增強HCC細胞對侖伐替尼的耐藥性。

4.2.3CircRNAs在肝癌瑞戈非尼耐藥中的作用及機制的研究進展 瑞戈非尼也是一種多靶點TKI，可以顯著提高HCC患者的總體生存率，但也不可避免的產生耐藥。Wang等[24]研究發現，與單獨使用瑞戈非尼治療相比，小檗堿和瑞戈非尼聯合治療對裸鼠HCC異種移植腫瘤的生長有更顯著的抑制作用；在體外實驗中，相比對照組HCC細胞(經DMSO處理)，小檗堿和瑞戈非尼聯合處理的HCC細胞有58個circRNAs顯著上調、19個circRNAs顯著下調。然而，這些差異表達circRNAs是否與小檗堿提高HCC對瑞戈非尼的敏感性有關？能否作為減少瑞戈非尼耐藥的候選靶標？有待進一步深入研究。

4.3 CircRNAs在肝癌免疫治療耐藥中的作用及機制的研究進展近年來腫瘤免疫治療發展迅猛，免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)藥物已成為包括肝癌等多種腫瘤治療的重要選擇。ICIs包括PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑和CTLA-4抑制劑。目前用于肝癌治療的PD-1/PD-L1抑制劑有納武利尤單抗、帕博利珠單抗、卡瑞利珠單抗、信迪利單抗、替雷利珠單抗和阿替利珠單抗，CTLA-4抑制劑有伊匹木單抗。盡管免疫治療取得了巨大的成功，但ICIs的先天性和獲得性耐藥性導致HCC患者的腫瘤復發和治療失敗成為限制其臨床應用的瓶頸問題。目前針對ICIs耐藥的研究較少，ICIs耐藥機制尚不明確。

Fig 1 CircRNAs regulated mode of drug resistance of liver cancer

Lu等[25]對6名接受PD-1抑制劑(納武利尤單抗)治療的晚期HCC患者的穿刺活檢腫瘤樣本進行circRNAs測序，發現在PD-1耐藥的HCC組織中24個circRNAs明顯上調、20個circRNAs明顯下調；其中circTMEM181的上調與PD-1耐藥密切相關，其機制為HCC細胞通過外泌體傳遞circTMEM181作用于巨噬細胞以增加其CD39表達，CD39與腫瘤細胞上的CD73協調導致腫瘤微環境中的腺苷升高使CD8+T細胞致殘，從而引起PD-1免疫治療的耐藥。Zhang等[26]研究發現，circUHRF1在PD-1(納武利尤單抗)治療后疾病進展組HCC患者的表達量顯著高于疾病穩定組和部分緩解組，并且在人HCC癌組織中的表達高于癌旁組織；circUHRF1高表達預示HCC患者預后較差和NK細胞功能障礙(比例降低、浸潤減少)；HCC細胞可通過外泌體分泌circUHRF1來抑制NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α分泌，并可通過吸附miR-449c-5p上調TIM-3的表達來抑制NK細胞功能，從而介導了HCC對PD-1抑制劑的耐藥。Huang等[27]研究發現，circMET在HCC組織高表達，并且與HCC患者的總生存時間負相關；circMET通過吸附miR-30-5p上調snail蛋白，繼而上調二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP4)，從而誘導趨化因子CXCL10降解，最終使腫瘤微環境中CD8+T細胞侵潤減少，產生免疫抑制性腫瘤微環境。在小鼠體內實驗中，與單獨使用PD-1抑制劑治療組相比，PD-1抑制劑和DPP4抑制劑(西格列汀)聯合治療對小鼠HCC異種移植腫瘤的生長有更顯著的抑制作用，說明由circMET介導的免疫抑制性腫瘤微環境可被DPP4抑制劑修復，DPP4抑制劑可提高PD-1抑制劑殺傷HCC細胞的作用。

5 總結與展望

我國是一個肝癌發病大國，廣大肝癌患者都一定程度上從各種藥物治中獲益，但原發性耐藥和獲得性耐藥嚴重限制了藥物的治療療效，耐藥問題迫待解決。為此，科學界，特別是我國學者近年來對此做了大量研究，涉及肝癌化療耐藥、肝癌靶向治療耐藥和肝癌免疫治療耐藥的機制研究和治療方案探索。綜上所述，circRNAs在肝癌耐藥中扮演了重要角色，其異常表達可導致肝癌耐藥的發生。CircRNAs主要是通過ceRNA機制吸附下游miRNAs，進而上調下游靶基因或靶蛋白的表達來參與肝癌耐藥。此外，circRNAs還可以通過調控腫瘤微環境中的免疫細胞功能來參與免疫治療藥物的耐藥。隨著研究的不斷深入，circRNAs有望成為克服肝癌耐藥的重要靶點。