藏藥四味黃芪散通過AMPK蛋白誘導的自噬信號通路干預低氧性肺動脈高壓的研究

李生花，楊全余，2，3，嘎 琴，2，3，靳國恩，2，3

(1.青海大學醫學院；2.青海省高原醫學應用基礎重點實驗室(青海-猶他高原醫學聯合重點實驗室)；3.教育部高原醫學重點實驗室，青海 西寧 810001)

高原肺動脈高壓(high altitude pulmonary hypertension，HAPH)是高原地區常見的一種疾病，是由于長期低氧刺激誘發肺血管結構重建，血管阻力增加，肺動脈壓持續升高，繼而引起右心室結構和功能改變的一種慢性疾病，嚴重者會導致右心衰或肺水腫而危及生命。由于機制不清，HAPH的有效治療仍是當前醫學難題，尋找有效的藥物作用靶點和挖掘中藏藥潛在的藥效價值是當前研究的主要方向之一。

中藏藥所具有的機體調理作用、多靶點作用和副作用小等特點，在治療慢性高原病方面獨具優勢。HAPH病理生理特點是由于肺血管平滑肌細胞增厚，管腔狹窄，血管內阻力增大，使得心臟和血管收縮產生的推動力受阻，其乃為“氣滯”現象，“氣滯”結果是使血液流動緩慢而不通暢，產生“血瘀”。藏藥四味黃芪散中的四味藥材主要來源于高寒缺氧地區，具有補氣和活血化瘀的藥效，該藥在前期研究中已發現有比較好的抗低氧效果[1]，但作用機制仍然不清楚。

HAPH主要病理特征是肺動脈平滑肌過度增殖，這也是肺動脈壓持續升高，藥物效果不佳的關鍵環節。細胞的自噬活動具有修復受損細胞的能力，在一定程度上具有保護組織的作用，而低氧在造成細胞損傷的同時也會促進自噬活動的增強，而自噬活動的增強又可抑制平滑肌細胞的增殖，從而減緩低氧性肺動脈壓的升高[2]，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)自噬信號通路，是能量代謝的“調節器”，一方面其可促進ATP生成，另一方面抑制組織對ATP的消耗。AMP/ATP比值升高可激活AMPK信號通路，而缺氧會引起 AMP/ATP比值升高。因此，本文通過藏藥四味黃芪散對AMPK誘導的自噬信號通路相關蛋白水平的影響，探討該信號通路是否參與低氧下肺動脈高壓的形成機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物和分組動物 由西安交通大學動物中心提供(SCXK(陜)2017-003)，該研究獲得青海大學醫學院動物實驗倫理委員會批準。110只SPF級別SD大鼠(160～200) g，均為雄性，隨機分成低氧對照組(50只)和低氧藥物組(50只)，兩組又根據暴露低氧時間分別細分為5個小組，即低氧1 d組、低氧3 d組、低氧7 d組、低氧15 d組和低氧30 d組，每小組10只大鼠，放置于模擬海拔5 000 m低壓氧艙，另有10只作為常氧對照組(西寧地區，海拔2 260 m)。

1.1.2儀器與試劑 青海大學低壓氧艙DYC-3000(中航風雷)，MP150用生理信號采集系統(美國Biopac)；Bio-Rad垂直電泳儀(美國伯樂公司)；Tecnai Spirit Bio TWIN FEI投射電子顯微鏡(美國FEI公司)；LEICA EM UC7超薄切片機(德國徠卡公司)；p-AMPK(EPR3051(ab92701，Abcam公司)；ULK-1(ab240916，abcam公司)；LC3重組抗體(EPR18709)。辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216，碧云天生物技術公司)和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(A0208，碧云天生物技術公司)。

1.2 方法

1.2.1動物模型構建 將100只SD大鼠置于低壓氧艙內，以2 m·s-1的速度升至模擬海拔5 000 m，艙內溫度(22±2) ℃，濕度50%～60%，采用慢性低壓低氧來模擬高原低氧環境(暴露低氧≤7 d為急性低氧，>7 d為慢性低氧暴露)，大鼠自由取食水。

1.2.2藥物及給藥方法 藏藥四味黃芪散水提液以備用。藏黃芪(內蒙古)，川芎(四川)，沉香(甘肅)，藏紅花(伊朗)四味藥，多用于治療腦中風等疾病，按臨床已明確的方劑量比例(40 g ∶20 g ∶20 g ∶1 g)稱重，再按物料比1 ∶12的比例加入水，用旋轉儀蒸煮，每次2 h，共3次，提取液濃縮至終濃度為0.84 kg·L-1。根據2015版中國藥典對復方中各飲片中活性成分進行含量測定，其中黃芪中黃芪甲苷含量為0.11%，川芎中阿魏酸含量為0.15%、沉香中沉香四醇含量為0.14%，西紅花苷中西紅花苷Ⅰ、Ⅱ含量分別為8.5%、3.1%。低氧藥物組給予藏藥四味黃芪散水劑灌胃(根據人和大鼠等效劑量換算，大鼠藥量為0.42 g/100 g體重)，每天1次；低氧對照組用0.9%生理鹽水灌胃。

1.2.3肺動脈壓(Ppa)和左右心室比重測定(RV/(LV+S)) 將大鼠給予25%烏拉坦(125 mg/100 g)麻醉，麻醉平穩后，仰臥位固定，分離出右側頸外靜脈，用肝素化的彎頭聚次亞乙烯管(內徑0.28 mm)沿頸外靜脈向向心端插入，通過顯示器觀察壓力波形變化，出現典型的肺動脈壓力波形后，固定好導管，用16導生理信號采集系統(MP150，美國Biopac公司)進行肺動脈壓進行測定，保存和分析；取出心臟，剪去左右心房組織，確定好右心室，沿右心室壁與心間隔連接處剪下整個右心室壁，采用電子秤對大鼠右心室質量和左心室+室間隔質量進行測定，求出比值。

1.2.4免疫印跡法 取適量冰凍肺組織，用適量裂解液處理至完全裂解，離心機離心，取上清液，用BCA試劑進行蛋白定量，根據標準曲線蛋白濃度符合要求后，進行蛋白質電泳(120 V電壓)、轉移、顯影等一系列處理之后，封閉并加已稀釋p-AMPK，ULK-1和LC3單克隆抗體(1 ∶1 000～3 000)，置于4 ℃環境16 h過夜，次日加羊抗兔二抗(1 ∶10 000)于室溫下進行搖床孵育1 h，然后洗膜3次，加ECL發光試劑，再在光化學發光成像儀曝光、拍照。用ImageJ軟件進行灰度值分析。

1.2.5光鏡觀察 將固定于4%多聚甲醛溶液中的肺組織取出，通過梯度濃度酒精脫水、二甲苯浸透、浸蠟包埋一系列過程，然后再通過切片、粘片、脫蠟、醇化和蘇木精、伊紅染色，最后在顯微鏡下觀察、拍片；電鏡觀察：取在2.5%戊二醛固定的1×1 ×3 mm3肺組織，磷酸緩沖液清洗后，用1%鋨酸固定，再經過脫水、置換、浸潤、樹脂聚合包埋、修塊，切片。染色，最后在電鏡下觀察、拍片。

2 結果

2.1 藏藥四味黃芪散對暴露于低壓低氧下大鼠肺動脈壓的影響低氧對照組大鼠暴露于低壓低氧環境后，隨暴露低氧時間的延長，肺動脈壓力逐漸升高，特別是于暴露低氧d 7出現明顯的變化(28.5±7.25) mmHg，于低氧30 d，肺動脈壓升高更加明顯，達到(34.8±4.30) mmHg(P<0.01)。藥物對照組大鼠暴露于低氧后，肺動脈壓也會隨暴露低氧時間的延長而升高，但與低氧對照組相比，其升高速率明顯減緩(P<0.05)，于低氧15 d，出現肺動脈壓的改變(24.2±2.68) mmHg，低氧30 d后其平均肺動脈壓為(26.2±3.03) mmHg，明顯低于同期低氧對照組大鼠水平(Fig 1，2)。

Fig 1 Pulmonary artery pressure curves of rats in hypoxic control group and hypoxic drug group exposed to hypoxic at different time points

Fig 2 Comparison of mean pulmonary artery pressure of rats between hypoxic control group and hypoxia drug group at different time points of exposure to hypoxia

2.2 藏藥四味黃芪散對暴露于低壓低氧下大鼠左右心室比值的影響低氧對照組大鼠左右心室比值變化趨勢同肺動脈壓變化，即隨暴露低氧時間延長，左右心室比值逐漸升高，暴露低氧d 7為(0.41±0.05)，與暴露低氧d 1的0.24±0.03相比，變化最為明顯(P<0.05)，隨后增加相對比較緩慢，至低氧30 d，其比值為0.45±0.04。而藥物組暴露低氧d 7，其左右心室比值為0.31±0.04，而暴露低氧30 d，其比值為0.38±0.03，即其右心室肥厚程度明顯低于低氧對照組(P<0.05)

Fig 3 Comparison of left and right ventricular mass ratio between hypoxic control group and hypoxic drug group at different time points of exposure to hypoxic

2.3 藏藥四味黃芪散對暴露于低壓低氧下大鼠肺動脈壁結構的影響與常氧組相比，隨著暴露于低壓低氧時間的延長，低氧對照組和低氧藥物組大鼠肺動脈壁均有逐漸增厚的趨勢，然而藥物組大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖明顯低于低氧對照組(P<0.05)(Fig 4A)。

Fig 4A Comparison of pulmonary vascular wall thickness between hypoxic drug group and hypoxic control group at different time points of exposure to hypoxia

電鏡觀察發現隨著暴露低氧時間的延長，低氧對照組大鼠肺組織細胞線粒體出現腫脹、溶解、嵴斷裂和脫顆粒現象，也可見肺泡Ⅱ型細胞板層結構呈現空泡樣狀，于低氧d 3、7、15最為明顯。然而，低氧藥物組大鼠肺組織細胞亞結構損傷相對減輕。

2.4 藏藥四味黃芪散對暴露于低壓低氧下大鼠肺組織 AMPK蛋白及其信號通路的影響從Fig 5A和Fig 5B可以看出，暴露低氧3 d和7 d時，低氧對照組大鼠肺組織磷酸化AMPK蛋白水平明顯升高，而在暴露低氧d 15、30時，該蛋白表達水平逐漸降低。相比于低氧對照組，低氧藥物組大鼠肺組織磷酸化AMPK蛋白表達在整個低氧暴露期均呈現更高的水平，隨著暴露低氧時間的延長，其磷酸化AMPK蛋白雖有降低的趨勢，但仍比低氧對照組高。同樣，Fig 5A和Fig 5C顯示，無論低氧對照組或是低氧藥物組ULK-1蛋白水平呈現表達增加的現象，并隨暴露低氧時間的延長而進一步增加，低氧30 d后突然降低，但低氧藥物組仍高于低氧對照組。Fig 5A和Fig 5D顯示，自噬蛋白LC3Ⅱ表達水平隨暴露低氧時間的延長而增加，尤以藥物干預組增加更為明顯。

Fig 4B Comparison of type Ⅱ cell substructure changes in lung tissues of rats in different groups at different time points of hypoxic exposure(×12 000)

另外，對電鏡下自噬小體的觀察，無論是低氧對照組還是低氧藥物組，其共同點就是暴露低氧d 1，均觀察不到自噬小體，但從d 3起，兩組均出現自噬小體，并且以急性低氧期為明顯。不同點是，隨著暴露低氧時間的延長，低氧對照組自噬體減少，而低氧藥物組自噬體仍然維持在較高的數量，見Fig 5E。

Fig 5A Changes of p-AMPK，ULK-1 and LC3Ⅱ protein level in lung tissues of rats in different groups under hypoxic

Fig 5B Comparison of p-AMPK/β- actin levels of lung tissues of rats in hypoxic control group and hypoxic drug group

Fig 5C Comparison of ULK-1/β- actin levels of lung tissues of rats in hypoxic control group and hypoxic drug group

Fig 5D Comparison of LC3Ⅱ/β- actin levels of lung tissues of rats in hypoxic control group and hypoxia drug group

Fig 5E Observation and comparison of autophagy corpuscles in lung tissues of rats exposed to hypoxic at different time points(×6 000)

3 討論

高原低氧環境對肺組織的影響是十分復雜的，特別是自噬活動對肺組織細胞的影響存在兩面性：損傷(或增殖)和修復(抑制)。兩者之間的轉換機制并不十分清楚，但自噬活動最初的目的就是對已經損傷的細胞進行修復，而對于無法修復的細胞通過過度激活的自噬活動將進一步觸發凋亡程序[3]。另一方面，自噬活動可具有抑制干細胞增殖[4]和平滑肌細胞增殖[5]的作用。本研究的生理、形態學結果顯示，藏藥四味黃芪散能夠明顯緩解低氧引起的大鼠肺動脈壓升高及右心室肥厚，尤其減緩了血管平滑肌層的厚度。這種作用機制是否與自噬活動有關？通過對AMPK自噬信號通路各蛋白測定，發現無論是低氧或是藥物均能增強自噬活動，而且與暴露低氧時間密切相關。雖然，低氧會促進AMPK蛋白的上調[6-7]，但本研究結果發現，急性低氧期磷酸化AMPK蛋白水平增加十分明顯，但在慢性低氧期，其水平略有降低趨勢，其原因可能與急性低氧損傷啟動了以自噬等修復功能為主的代償反應，隨著慢性低氧對機體損傷的減弱，其自噬活動也出現相應的改變，也或許出現了自噬活動的“鈍化”現象。而四味黃芪散可以進一步上調磷酸化AMPK蛋白的表達，能夠保持AMPK在一定水平以維持其適宜的自噬活動，有助于對細胞損傷的修復和平滑肌細胞增殖的抑制，該藥的抗慢性低氧效果要比抗急性低氧的效果明顯。同樣，對AMPK自噬信號通路中的下游蛋白ULK-1和自噬蛋白LC3I和LC3Ⅱ水平進行分析發現，無論是低氧對照組或是藥物干預組，ULK-1和LC3Ⅱ蛋白表達水平均隨暴露低氧時間的延長而增加，低氧藥物組肺組織中的ULK-1和LC3Ⅱ蛋白表達水平在低氧初期雖高于常氧對照組，但仍低于低氧對照組。然而，隨著暴露低氧的延長，特別是在低氧15 d以后，四味黃芪散上調ULK-1和LC3Ⅱ的作用明顯提高。急性期ULK-1和LC3Ⅱ蛋白增高，表明組織受急性低氧損傷的同時，自噬修復能力也增強。但自噬活動不是越強越好，過度自噬會觸發凋亡程序[8-9]，甚至加重細胞的死亡[10-11]。

因此，急性低氧期，四味黃芪散能夠適當降低其自噬水平，可能與其防止平滑肌細胞自噬的過度活動有關，而慢性低氧下，低氧誘導的自噬活動逐漸減弱，但平滑肌細胞增殖逐漸增強，其時藥物能夠增強自噬活動發揮預防肺動脈平滑肌的過度增殖，該藥物所具有的的兩面性可能與其所特有的調理作用有關。研究的結果還表明，急、慢性低氧下磷酸化AMPK、ULK-1和LC3Ⅱ蛋白表達水平并非完全一致，可能與該信號通路的調節復雜性有關，如mTOR蛋白水平，一種抗凋亡因子，因為ULK-1蛋白可以被mTOR蛋白所抑制[12-13]。另外，自噬活動并非AMPK-ULK-1這一條途徑調控，還受其他自噬信號通路或自噬蛋白、抗凋亡蛋白的調節，如Becline-1、Bcl-2等。有研究認為磷酸化AMPK和總AMPK蛋白對下游蛋白皆有調節，只是調節的程度存在差異[14-15]，甚至有研究[16]認為，藥物激活AMPK不僅僅使ɑ亞基的磷酸化，也可以使AMPK復合物全部被激活的可能，這些因素也導致磷酸化AMPK水平與其下有游蛋白存在不一致。當然，大量的研究發現，自噬活動與平滑肌細胞的增殖活動仍然存在矛盾的地方，而本研究所表現出藥物對自噬活動的干預能否闡明低氧下肺血管重構有關？仍值得關注。