雷公藤二萜類化合物通過抑制多條信號通路緩解巨噬細胞炎癥反應

饒凱瑞，廖彩岑，伊 然，杜欣燁，周曉瓊，李蓉濤，劉 丹

(昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500)

炎癥是對有害刺激(如病原體、受損細胞、有毒化合物或輻射)的一種先天免疫反應，但是不受控制的炎癥可能會導致組織損傷或各種慢性炎癥性疾病[1]，因此，控制炎癥的持續時間和程度是非常有必要的。巨噬細胞是一種高度異質的細胞，具有抗原提呈與加工、免疫調節、吞噬等功能，可根據局部微環境迅速改變其功能，它可以吞噬死亡細胞和細胞碎片，并招募更多的巨噬細胞以響應炎癥信號[2]，但吞噬活動發生的同時也會導致炎癥體的活化，使炎癥反應過度并對機體產生損害[3]。

脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細胞外膜的主要成分[4]，它通過與其特異性受體Toll樣受體4(TLR4)結合并激活MyD88，從而激活多條參與巨噬細胞免疫應答的通路，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、核轉錄-κB(NF-κB)通路和JAK-STAT通路等，這些通路可以促進炎性介質(COX-2和iNOS)和細胞炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α等)的生成[4-6]。NF-κB是最重要的轉錄因子之一，大量參與炎癥反應基因的表達都受到NF-κB的調控，如COX-2、iNOS、促炎細胞因子(IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α)、趨化因子、黏附分子、免疫受體、生長因子以及其他與增殖和侵襲有關的因子。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)和細胞外信號調節激酶(ERK)是MAPK超家族的成員，它們在細胞應激時被激活，能夠誘導NF-κB的核轉位和上調促炎細胞因子的表達，在炎癥反應中發揮重要作用[5-6]。巨噬細胞的炎癥反應中，MAPK位于NF-κB的上游，抑制其磷酸化可以導致LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞中IκBα降解的減少，進而下調p65的激活[1,7]。核苷結合寡聚域(NOD)樣受體(NLR)家族pyrin結構域3(nucleotide-binding oligo-merization domain(NOD)like receptors(NLR)pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎性小體是一種多蛋白復合體，能夠激活caspase-1，caspase-1作為一種效應因子，能夠切割蛋白質，將pro-IL-1β和pro-IL-18分別加工為成熟的促炎細胞因子IL-1β和IL-18[8]，從而促進炎癥反應的發生。模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)是機體先天免疫系統的重要組成部分，PRRs會促進NF-κB途徑和MAPK途徑的激活，從而增加與NLRP3炎癥體相關蛋白編碼基因的轉錄[9]。

雷公藤(Tripterygiumwilfordii)屬于衛矛科雷公藤屬植物, 是一種傳統的中草藥。雷公藤最早記載于《神農本草經》，在中國、日本和朝鮮已經被廣泛使用了幾個世紀[10]。雷公藤中含有70多種成分，包括二萜、三萜類、苷類和生物堿[11]，其中95%是萜類化合物。雷公藤具有免疫抑制、抗腫瘤、抗炎、抗HIV等功效，臨床上常用于治療免疫和炎性疾病，而二萜類成分被認為是這些活性的主要來源[12]。LPS誘導的RAW264.7細胞是炎癥研究的經典模型，被廣泛用于巨噬細胞相關炎癥信號通路的研究中[4-5]。為了探究雷公藤二萜類化合物抗炎活性的具體作用機制，本研究采用LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，對我們前期工作中從雷公藤中分離得到的一系列二萜類化合物進行抗炎活性篩選，發現其中包括松香烷型二萜、海松烷型二萜在內的7個化合物對NO的生成具有明顯的抑制作用，對其中活性較好化合物進行抗炎機制探索，旨在進一步明確它們的作用機制。

1 材料

1.1 細胞株小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫。

1.2 藥材與試劑雷公藤干燥的莖于2019年7月購自于昆明市新螺螄灣藥材市場，并由昆明理工大學陳宣欽老師鑒定為雷公藤(Tripterygiumwilfordii)，樣品標本(KUMST20190716)存放在昆明理工大學生命科學與技術學院天然藥物化學重點實驗室。

DMEM培養基和胎牛血清購自美國Thermo Fisher公司，噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和青鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司，Griess試劑、一氧化氮合酶抑制劑(L-NMMA)和辣根過氧化物酶二抗購自上海碧云天生物技術有限公司，脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司，ELISA試劑盒(IL-6、IL-1β、TNF-α)購自美國Novus Biologicals公司，IL-18的ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，羧酸鹽修飾熒光微球(F8827)購自美國Invitrogen公司。

1.3 儀器Agilent 1200/1260高效液相色譜儀、分析型色譜柱Zrobax SB-C18反相柱、半制備型Zrobax SB-C18與C8反相柱均為Agilent公司產品；Western blot電泳儀，美國Bio-Rad公司產品；CO2恒溫培養箱，美國Thermo Fisher公司產品；Spectra Max M2多功能讀板機，美國Moleccular Devices公司產品。

2 方法

2.1 細胞培養小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM培養基置于37 ℃，5% CO2培養箱中進行傳代培養，收集對數生長期的細胞用于后續的實驗。

2.2 樣品配置精密稱取化合物適量，用DMSO試劑配置成濃度為50 mmol·L-1的母液備用，4 ℃冰箱保存。

2.3 MTT法檢測細胞活度取對數生長期RAW264.7細胞，按照3×104/孔接種到96孔細胞培養板內，置于37 ℃培養箱中培養24 h后，加入不同濃度的化合物(3.125、6.25、12.5、25、50 μmol·L-1)繼續培養24 h，設置正常對照組(細胞+樣品等量DMSO)和空白對照組(樣品等量DMSO)。加入20 μL/孔MTT(5 g·L-1)繼續孵育培養3.5 h后，吸去孔內的液體，加入150 μL/孔DMSO，避光振蕩10 min使其混勻，多功能讀板機490 nm處測量吸光度。

細胞活度/%=(OD實驗組-OD空白對照組)/(OD正常對照組-OD空白對照組)×100%

2.4 Griess法檢測NO含量取對數生長期RAW264.7細胞按照4×104/孔接種到 96孔細胞培養板內，置于37 ℃培養箱中培養24 h后，設置對照組(細胞+樣品等濃度DMSO)、模型組(細胞+樣品等濃度DMSO+100 μg·L-1LPS)和給藥組(細胞+不同濃度化合物+100 μg·L-1LPS)繼續孵育培養24 h后，收集上清后加入Griess試劑，多功能讀板機540 nm處測量吸光度。

NO抑制率/%=(OD模型組-OD給藥組)/(OD模型組-OD對照組)×100%

2.5 ELISA法檢測細胞因子的分泌取對數生長期RAW264.7細胞，按照1.5×105/孔接種到12孔細胞培養板內，置于37 ℃培養箱中培養24 h后，分組處理同“2.4”，化合物預處理2 h后，再加入100 μg·L-1的LPS共同孵育24 h，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α的含量。

2.6 Western blot實驗取對數生長期RAW264.7細胞，按照1.5×105個/孔接種到12孔細胞培養板內，置于37 ℃培養箱中培養24 h后，分組處理同“2.4”，化合物預處理2 h后，再加入100 μg·L-1的LPS共同孵育30 min(MAPK、NF-κB)或24 h(COX-2、iNOS、NLRP3、caspase-1、cleaved-caspase-1、STAT3)，加入含1%蛋白酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液裂解蛋白。蛋白樣品經10%的SDS-PAGE凝膠分離并轉移到PVDF膜上，在4 ℃封閉液中封閉2 h后一抗中低溫孵育過夜，再用相對應的二抗室溫孵育1 h，經ECL化學發光并用成像儀進行顯影，實驗結果用ImageJ軟件分析，用GraphPad Prism軟件作圖。

2.7 上清蛋白富集細胞處理同“2.5”，用1.5 mL的EP管收集上清液體與三氯乙酸按照4 ∶1混勻，置于冰上1 h后，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，小心地吸去上清，每個EP管加入1 mL預冷的丙酮吹打沉淀，12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，重復3次，等丙酮揮發之后加入loading buffer制備蛋白樣品(富集上清中蛋白用于檢測cleaved-caspase-1)。

2.8 吞噬實驗取對數生長期RAW264.7細胞，按照1.5×105個/孔接種到12孔細胞培養板內，置于37 ℃培養箱中培養24 h后，分組處理同“2.4”，給藥24 h后棄去上清，每孔1 mL PBS小心清洗2次后，每孔加入1.5 mL的DMEM培養基和100 μL熒光微球(按照說明書提前配置好)，然后在CO2培養箱避光孵育2 h，反應結束后棄去上清，每孔用1 mL的PBS小心清洗2次后，收集細胞于1.5 mL的EP管中，每管加入1 mL的PBS吹打均勻后，用流式細胞儀進行分析。

吞噬百分率/%=已吞噬的巨噬細胞/巨噬細胞總數×100%

2.9 統計學分析使用SPSS 23.0進行數據分析，實驗結果用表示，組間差異使用單因素方差分析(One-way Anova)。

3 結果

3.1 雷公藤二萜類化合物對RAW264.7細胞活力及NO生成的影響我們在之前的工作中從干燥的雷公藤莖中分離得到了一系列化合物并進行了結構鑒定[13-14]，為了尋找雷公藤中的活性物質，我們對其中分離得到的二萜類化合物進行了抗炎活性篩選，其中7個化合物具有抗炎活性，結構式如Fig 1所示。結果如Tab 1所示，雷公藤二萜類化合物1和6在50 μmol·L-1濃度內對RAW264.7細胞的細胞活力沒有明顯的影響；雷公藤二萜類化合物1、2、4、5、7、8、和9對NO的生成具有明顯的抑制作用，IC50分別為(7.0±2.8)、(7.3±2.4)、(3.2±0.2)、(1.7±0.4)、(1.9±0.2)、(1.8±0.6)和(7.9±1.7) μmol·L-1，綜上實驗結果，我們選擇雷公藤二萜類化合物1和6進行進一步的研究。

Fig 1 The structural formulas of seven compounds isolated from Tripterygium wilfordii

Tab1 Effects of seven compounds on cell activity and NO production of RAW264.7

3.2 雷公藤二萜類化合物對巨噬細胞中多種細胞因子的影響為了更進一步的確認雷公藤二萜類化合物1和6的抗炎活性，我們檢測了其對LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α分泌的影響，如Fig 2所示，與對照組相比，LPS誘導激活巨噬細胞炎癥反應，明顯增加IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌；與LPS組相比，化合物組呈劑量依賴性明顯抑制IL-6、IL-1β和IL-18的分泌，但對TNF-α的分泌沒有明顯的影響。

Fig 2 Effects of compound 1 and 6 on secretion of cytokines in RAW264.7 n=3)##P<0.01 vs Control;**P<0.01 vs LPS.1：hypoglicin H；6：ent-pimara-8(14),15-diene-19-ol

3.3 雷公藤二萜類化合物對巨噬細胞中MAPK信號通路的影響為了明確雷公藤二萜類化合物1和6的抗炎作用機制，我們檢測了其對MAPK信號通路的影響，如Fig 3所示，與對照組相比，LPS處理激活RAW264.7細胞中MAPK信號通路，JNK、p38、ERK蛋白磷酸化明顯增加；與LPS組相比，化合物組JNK、p38、ERK蛋白磷酸化的水平明顯降低。這表明化合物可能是通過抑制MAPK信號通路的激活來發揮抗炎作用。

Fig 3 Effects of compound 1 and 6 on JNK, p38, ERK and their phosphorylation in LPS-induced RAW264.7 n=3)

3.4 雷公藤二萜類化合物對巨噬細胞中IκBα，STAT3及其磷酸化的影響為了進一步明確雷公藤二萜類化合物1和6的抗炎作用機制，我們檢測了其對LPS誘導的RAW264.7細胞中IκBα，STAT3及其磷酸化的影響，如Fig 4所示，與對照組相比，LPS處理明顯促進RAW264.7細胞中IκBα磷酸化，激活NF-κB信號通路，同時還引起STAT3的高度磷酸化，而化合物組呈劑量依賴性明顯抑制RAW264.7細胞中的IκBα，STAT3磷酸化。這表明化合物可能是通過抑制NF-κB信號通路的激活以及STAT3的磷酸化來發揮抗炎作用。

Fig 4 Effects of compounds on IκBα, STAT3 and their phosphorylation in Raw264.7 n=3)

3.5 雷公藤二萜類化合物對巨噬細胞中COX-2、iNOS表達和炎癥小體生成的影響誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和環氧合酶(COX-2)在炎癥相關疾病的發展中起著關鍵作用，我們檢測雷公藤二萜類化合物1和6對LPS誘導的RAW264.7細胞中COX-2、iNOS、NLRP3、caspase-1、cleaved-caspase-1的影響，如Fig 5所示，與對照組相比，LPS誘導的RAW264.7細胞中COX-2、iNOS、NLRP3、cleaved-caspase-1明顯增加；與LPS組相比，化合物組呈劑量依賴性明顯抑制RAW264.7細胞中的COX-2、iNOS、NLRP3、cleaved-caspase-1。

Fig 5 Effects of compounds on COX-2, iNOS, NLRP3, caspase1, cleaved-caspase1 in Raw264.7 n=3)

3.6 雷公藤二萜類化合物對對巨噬細胞吞噬功能的影響為了明確雷公藤二萜類化合物1和6是否能夠調節巨噬細胞的吞噬功能，我們檢測其對巨噬細胞吞噬功能的影響，結果如Fig 6所示，與空白組巨噬細胞吞噬百分率(34.71%)相比，LPS誘導RAW264.7細胞后能夠增強其吞噬能力(47.32%)，化合物單獨處理巨噬細胞和化合物與LPS共同處理巨噬細胞的條件下，巨噬細胞的吞噬功能均被抑制。

4 討論

巨噬細胞是免疫系統啟動和調節免疫反應的哨兵，在應對病原菌、病毒、真菌等的免疫應答中起著關鍵的作用，它能夠產生和分泌細胞因子，細胞因子可以調節感染或炎癥的免疫反應，并通過復雜的相互作用網絡調節炎癥本身[2]。LPS作用于TLR4與受體結合后可以在巨噬細胞中引發多種炎癥反應，介導促炎細胞因子、生長因子、趨化因子等的合成和釋放[4-6]。

在LPS刺激下，JAK/STAT通路被激活，導致STAT3上705殘基和STAT1上701殘基酪氨酸被磷酸化[15]。STAT3被認為是免疫和炎癥途徑中的關鍵轉錄因子，STAT3可以通過延長RELA的核滯留在慢性炎癥期間和轉化細胞中維持NF-κB的持續激活，并且STAT3和NF-κB在多個水平上相互作用，兩者都能調節炎癥介質的表達，COX-2、iNOS和IL-6、TNF-α都受到NF-κB和STAT3的調控[16]。雷公藤的提取物在中國已被廣泛用于治療各種自身免疫性和炎癥性疾病，包括類風濕性關節炎(RA)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、強直性脊柱炎、牛皮癬等[10-12]。

為了探究雷公藤二萜類化合物1和6抗炎活性的具體作用機制，本研究檢測了LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型中相關炎性介質的生成和炎癥相關蛋白的表達。脂多糖激活的MAPK在炎性介質因子的分泌和p65的轉位中起重要作用[1]，MAPK和NF-κB都介導炎性介質(COX-2和iNOS)和細胞炎性因子(IL-6、IL-1β、IL-18等)的生成[5-7]，研究結果顯示雷公藤二萜類化合物1和6呈劑量依賴性的抑制ERK、JNK、p38、IκBα的磷酸化，但是對ERK、JNK、p38、IκBα蛋白的表達沒有明顯的變化，這表明雷公藤二萜類化合物1和6發揮抗炎作用可能是通過抑制MAPK相關蛋白磷酸化水平，使LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞中IκBα降解的減少，導致下調p65的激活，進而抑制炎性介質(COX-2和iNOS)和細胞炎性因子IL-6、IL-1β、IL-18的生成。

此外，本研究還發現雷公藤二萜類化合物1和6呈劑量依賴性的抑制NLRP3，cleaved-caspase-1的活化和STAT3的磷酸化水平。在巨噬細胞的免疫反應中，炎性小體是介導炎癥反應的重要因素，NLRP3能夠激活caspase-1，從而介導促炎細胞因子IL-1β和IL-18的分泌[9]，促進炎癥反應的發生。NF-κB途徑和MAPK途徑的激活也會促進NLRP3炎癥體的生成[5,9]。并且有研究表明，抑制STAT3的磷酸化可以抑制下游的促炎細胞因子以及NLRP3啟動子上組蛋白H3和H4的乙酰化，從而抑制NLRP3炎癥小體的活化來介導炎癥反應的進程[17]。

綜上所述，雷公藤二萜類化合物1和6可能是通過抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中MAPK和NF-κB信號通路以及STAT3磷酸化，減少炎癥小體NLRP3的活化，降低炎性介質(COX-2和iNOS)和細胞因子(IL-6、IL-1β和IL-18)的表達來發揮抗炎作用，同時巨噬細胞的吞噬功能也受到抑制。本研究為闡明雷公藤二萜化合物抗炎活性的機制研究提供了理論依據和實驗基礎。