新型磷酸二酯酶5抑制劑CPD1對單側(cè)輸尿管梗阻引起的腎間質(zhì)纖維化小鼠治療作用

劉傲璐，任 倩，封文斌，李 斌，陳心慧，李思蓉，趙子建，穆云萍，李芳紅

(1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006，2.南方醫(yī)科大學(xué)，南方醫(yī)院腎內(nèi)科，器官衰竭防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家腎臟病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510515)

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病發(fā)展到末期的共同病理結(jié)果，常伴有腎小管萎縮和細(xì)胞外基質(zhì)ECM(纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原)沉積、肌成纖維細(xì)胞數(shù)量增加、毛細(xì)血管閉塞、大量炎癥細(xì)胞浸潤，其纖維化程度與腎功能衰竭程度密切相關(guān)[1]。全世界70歲以上的成年人中，有一半患有慢性腎病，占總?cè)丝诘?0%[2]。目前還沒有減緩腎纖維化的靶向治療方法，很大一部分慢性腎病患者最終發(fā)展為終末期腎功能衰竭，只能依賴透析或腎移植維持生命。隨著全世界腎衰竭發(fā)生率的不斷上升，慢性腎病已成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題，預(yù)防或延緩導(dǎo)致終末期腎衰竭的腎功能不全是慢性腎病藥物研發(fā)的最重要目標(biāo)。因此，開發(fā)有效的治療藥物對于阻止疾病惡化至關(guān)重要。單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteric obstruction，UUO)模型是目前研究最廣泛的腎間質(zhì)纖維化動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停撃Ｐ驮炷r(shí)間短，重復(fù)性好，可很好的模擬臨床上輸尿管梗阻性疾病以及腎纖維化的過程[3]。

磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDEs)抑制劑是一種抑制PDEs活性的藥物，廣泛應(yīng)用于勃起功能障礙、肺動脈高壓、心衰、哮喘等疾病中[4]。越來越多的研究顯示，PDE5抑制劑他達(dá)拉非[5]、西地那非、伐地那非[6]具有改善腎纖維化的作用。而傳統(tǒng)的PDE5抑制劑選擇性低、水溶性差、半衰期短(西地那非)，導(dǎo)致生物利用度低、副作用強(qiáng)，因此，本課題組在中國專利(CN102020645A)[7]公開的西地那非類似物WYQ基礎(chǔ)上，對其結(jié)構(gòu)繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化改造，通過成鹽和共晶篩選，最終選出優(yōu)良晶型CPD1(Fig 1)，其水溶性及腸溶性得到大幅提升，降低了藥物治療劑量，從而提升生物利用度[8]。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)，CPD1可通過抑制肺動脈高壓模型大鼠的肺動脈平滑肌細(xì)胞中鈣通道功能治療肺動脈高壓[9]，因此，本研究繼續(xù)探索了CPD1在腎臟疾病中發(fā)揮的作用。

Fig 1 The structural formula of CPD1

本研究使用UUO小鼠模型，觀察新型PDE5抑制劑CPD1對腎纖維化病理學(xué)組織結(jié)構(gòu)的改善，膠原纖維的沉積以及纖維化標(biāo)志蛋白和腎損傷分子表達(dá)水平的影響。初步驗(yàn)證CPD1對腎間質(zhì)纖維化的治療作用，為進(jìn)一步探討CPD1作用于腎間質(zhì)纖維化的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 ♂ C57BL/6 J小鼠(8周齡)，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司(43072711100365523)，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SYXK(粵)2017-0125。本實(shí)驗(yàn)方案嚴(yán)格遵循廣東藥科大學(xué)動物倫理委員會(編號：gdpulacspf2017027)制定的動物護(hù)理方針。

1.1.2試劑 CPD1(ET32637-37-P1)委托天津藥明康德新藥開發(fā)有限公司合成，CPD1經(jīng)COA分析測定純度達(dá)99%。青霉素、二甲苯、無水乙醇購自美國sigma aldrich公司。SDS、甘氨酸、吐溫20、30%Acrylamide、1.0 mol·L-1Tris-HCl(pH 6.8)、1.5 mol·L-1Tris-HCL(pH8.8)、40×TBST粉劑均購自上海生工生物技術(shù)有限公司。HE染色試劑盒(C0105)，Sirius Red試劑盒(Solarbio，G1470)，SP試劑盒(中杉金橋，SP-9001)，DAB(中杉金橋，ZLI-9017)，RIPA裂解液(碧云天P0013B)、磷酸酶蛋白酶抑制劑(碧云天P1051)、PMSF(碧云天ST506)。一抗：α-SMA(CST 19245)、FN(ab 2413)、Collagen-I(CST 91144)、Kim-1(R&D AF1817)、α-tubulin(sigma T5168)，二抗(JAX 111-035-003)。脫脂奶粉，BSA(上海生工)。

1.1.3儀器 分析天平(BP221S，德國Sartorius)，倒置顯微鏡(Leica德國)，ChemiDoc+XRS化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，移液器(Eppendorf)，烘箱(DH6-9143B5-Ⅲ，上海新苗)，石蠟包埋機(jī)(MPS/P1，德國SLEE)，低溫離心機(jī)(美國Thermo)，-80 ℃冰箱(中國美菱)，純水儀(EPED-2TF)。

1.2 方法

1.2.1UUO小鼠模型的構(gòu)建 將體質(zhì)量為20～22 g的雄性C57BL/6 J小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為假手術(shù)組、單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(UUO模型組)、單側(cè)輸尿管結(jié)扎CPD1干預(yù)組(UUO+CPD1(5 mg·kg-1))。手術(shù)前稱重，用1.25%三溴乙醇腹腔注射麻醉小鼠，剔除小鼠左側(cè)腹部毛發(fā)，75%酒精常規(guī)消毒后，將小鼠右側(cè)臥固定于手術(shù)臺上。于腹部左側(cè)斜切約0.5 cm皮膚切口，逐層剪開腹壁，彎鑷撥開脂肪暴露并游離左側(cè)腎臟和輸尿管，用5-0細(xì)線將輸尿管兩點(diǎn)結(jié)扎后從中間剪斷。結(jié)扎成功后用抗生素清洗腹腔、逐層縫合、涂抹碘伏，并將小鼠置于恒溫墊上待其蘇醒。假手術(shù)組經(jīng)過同樣的操作步驟僅游離輸尿管，不結(jié)扎。治療組：將CPD1溶于生理鹽水，于造模2 h后予以藥物灌胃治療，每天1次，持續(xù)7 d，假手術(shù)組和模型組予以同體積生理鹽水直至模型結(jié)束。

1.2.2標(biāo)本收集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將小鼠安樂死，摘取小鼠患側(cè)腎臟，快速投入冰PBS中清洗表明血漬，摘取的腎臟沿冠狀面切開，一部分置于4%多聚甲醛固定液中固定，另一部分組織凍于液氮中保存進(jìn)行后續(xù)Western blot檢測。

1.2.3腎臟HE、Sirius Red染色 腎臟組織固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切成厚3 μm切片，進(jìn)行HE和Sirius Red染色，觀察腎臟病理形態(tài)學(xué)改變和腎臟膠原纖維的沉積。

1.2.4腎臟免疫組化染色 切片常規(guī)脫蠟至蒸餾水，PBST洗3次，抗原修復(fù)，加入金橋SP-9001試劑1阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育10 min。用山羊血清室溫封閉1 h。孵育一抗α-SMA(1 ∶100)/FN(1 ∶100) 4 ℃過夜。d 2 PBST洗3次后，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物，室溫孵育15 min，PBST洗3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，PBST洗3次。DAB顯色，蘇木精復(fù)染3 min，分化、反藍(lán)、脫水、透明、封片。

1.2.5腎臟Western blot檢測 取適量腎臟組織于加入磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，充分研磨后，4 ℃，12 000×g，離心20 min，取上清得組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后于 -80 ℃ 保存。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣30～40 μg總蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃過夜孵育：α-SMA(1 ∶1 000)、FN(1 ∶1 000)、collagen-I(1 ∶1 000)、Kim-1(1 ∶1 000)、α-tubulin(1 ∶5 000)，室溫孵育二抗(1 ∶5 000)1 h。點(diǎn)化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，采用Image Lab軟件進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 CPD1對UUO模型小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷的影響HE染色觀察CPD1治療對UUO小鼠患側(cè)腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷情況的影響。結(jié)果顯示：假手術(shù)組(sham)小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)基本正常無病變，腎小管飽滿；UUO模型組小鼠組織中腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞可見疏松、腫脹和空泡變性，腎小球基底膜增厚，腎臟間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤明顯，腎間質(zhì)寬度增加，纖維化明顯；與UUO模型組相比，UUO+CPD1治療組中腎小管空泡變性較少，病變程度明顯減輕(Fig 2)。提示CPD1可有效改善輸尿管梗阻引起的腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷。

Fig 2 CPD1 alleviated UUO-mediated renal pathological injuryHE staining of kidney tissue sections. Scale bar，200 μm (A) and 100 μm (B).

2.2 CPD1對UUO模型小鼠腎臟腎間質(zhì)膠原纖維沉積的影響利用Sirius Red染色觀察CPD1對UUO小鼠腎臟組織膠原纖維沉積情況的影響。結(jié)果顯示：sham組小鼠患側(cè)腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，基本無紅色陽性著色，膠原陽性染色區(qū)域主要位于系膜區(qū)、腎小管間質(zhì)的毛細(xì)血管周圍；UUO模型組腎臟間質(zhì)及小管處可見明顯的天狼星紅陽性區(qū)域，表明有大量膠原沉積；與模型組相比，UUO+CPD1治療組中小管間質(zhì)膠原沉積明顯減少(Fig 3)，表明CPD1干預(yù)可明顯減少輸尿管梗阻引起的腎間質(zhì)膠原纖維沉積，延緩腎纖維化的進(jìn)展。

Fig 3 CPD1 alleviated UUO-mediated renal collagen depositionSirius Red staining of kidney tissue sections. Scale bar=50 μm.

2.3 CPD1對UUO小鼠腎臟組織纖維化標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響為了進(jìn)一步探究CPD1對纖維化標(biāo)志蛋白表達(dá)的作用，利用免疫組化染色(IHC)和Western blot方法檢測了小鼠腎臟組織中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ)和腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，Kim-1)的分布情況及表達(dá)水平。IHC結(jié)果顯示：與sham組相比，UUO模型組腎臟間質(zhì)處可見大量α-SMA(Fig 4)和FN(Fig 5)著色陽性區(qū)域；UUO+CPD1治療組中陽性著色面積明顯低于模型組(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示：經(jīng)CPD1干預(yù)后，纖維化蛋白標(biāo)志分子FN、collagen-I、α-SMA的表達(dá)水平明顯性降低，該結(jié)果與免疫組化染色結(jié)果一致。UUO+CPD1治療組中腎損傷分子Kim-1的表達(dá)也明顯低于模型組(P<0.05)(Fig 6)，提示CPD1明顯降低UUO小鼠患側(cè)腎臟組織中纖維化標(biāo)志蛋白的表達(dá)，減輕輸尿管梗阻引起的腎損傷，有效延緩疾病進(jìn)展。

Fig 4 Effect of CPD1 on α-SMA expression in UUO mouse kidney by IHCScale bar，200 μm (A) and 100 μm (B). Statistical analysis. **P<0.01 vs sham; #P<0.05 vs UUO (C).

Fig 5 Effect of CPD1 on Fn expression in UUO mouse kidney by IHCScale bar，200 μm (A) and 100 μm (B). Statistical analysis. **P<0.01 vs sham;#P<0.05 vs UUO (C).

Fig 6 Effect of CPD1 on protein levels of of FN，collagen-I，α-SMA，Kim-1 in UUO mouse kidney by Western blot

3 討論

腎纖維化是創(chuàng)面愈合過程的病理延伸，以損傷、炎癥、肌成纖維細(xì)胞激活和遷移、基質(zhì)沉積和重塑為特征，是所有慢性和進(jìn)行性腎病的共同最終途徑，也是腎功能不全的主要決定因素[10]。在UUO模型中，梗阻造成的壓力使輸尿管擴(kuò)張，壓力傳至腎小管導(dǎo)致小管上皮細(xì)胞受到機(jī)械性損傷，腎小球?yàn)V過率(GFR)降低。在UUO早期的1～2 h內(nèi)腎血流量(RBF)增加，隨著阻塞時(shí)間的延長，RBF逐漸減少，使毛細(xì)血管收縮導(dǎo)致血供不足。當(dāng)腎臟輕度損傷后，由肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)最初可能有助于組織修復(fù)過程，隨后即被再吸收。然而，在CKD發(fā)生的慢性損傷中，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白持續(xù)不受抑制的過度沉積，致使毛細(xì)血管稀疏，減少了腎小管周圍的血流量，導(dǎo)致腎小管缺氧和腎單位脫落，最終破壞器官結(jié)構(gòu)、導(dǎo)致腎功能衰竭。因此，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積是改善腎纖維化的首要目標(biāo)，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPD1可使腎臟組織結(jié)構(gòu)得到改善，降低細(xì)胞外基質(zhì)膠原的沉積。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，在生理狀態(tài)下主要表達(dá)于平滑肌組織和心肌組織中，腎臟中表達(dá)較低。而在病理?xiàng)l件下，發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，使α-SMA的表達(dá)升高，因此α-SMA的表達(dá)水平反映了腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。Fibronectin主要由腎小球系膜細(xì)胞分泌，分布在系膜區(qū)，在正常腎臟組織中表達(dá)較低，有研究發(fā)現(xiàn)，UUO模型中腎臟組織fibronectin的表達(dá)量與造模時(shí)間成正比，反映了纖維化的嚴(yán)重程度[11]。本研究結(jié)果顯示，UUO模型小鼠經(jīng)CPD1干預(yù)后，α-SMA和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白fibronectin、collagen-I的表達(dá)均得到明顯抑制。Kim-1是一種磷脂酰絲氨酸受體，由受損的近端腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，在腎小管間質(zhì)纖維化過程中起重要作用。在臨床研究中，Kim-1被作為腎小管損傷的早期診斷指標(biāo)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，CPD1干預(yù)可有效降低Kim-1蛋白的表達(dá)，表明CPD1通過下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)ECM沉積，減少Kim-1介導(dǎo)的腎損傷，抑制單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展，CPD1可能參與了腎小管上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及對系膜細(xì)胞的激活抑制具有調(diào)控作用。

環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)是重要的第二信使，在不同的器官和細(xì)胞類型中調(diào)節(jié)各種生理功能，如血管擴(kuò)張、炎癥和凋亡。有研究報(bào)道，提高cGMP水平對包括腎臟在內(nèi)的各種器官均顯示出有效的抗纖維化效果[13]。cGMP的細(xì)胞濃度是由其合成和降解之間的平衡決定的，磷酸二酯酶5(PDE5)是特異性催化cGMP水解的酶，可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)刺激劑和PDE5抑制劑，均可使cGMP濃度增加[14]。PDE5抑制劑通過其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在治療慢性腎病(CKD)患者的腎纖維化方面顯示出潛力[15]。本課題組自主研發(fā)的新型PDE5抑制劑CPD1克服了傳統(tǒng)的PDE5抑制劑水溶性和腸溶性差、對PDE5特異性不強(qiáng)(西地那非對PDE5特異性僅為PDE6的10倍，而WYQ有3 000倍)、副作用較大的缺點(diǎn)，有效提高了藥物生物利用度且具有更穩(wěn)定的理化性質(zhì)(中國發(fā)明專利申請?zhí)枺?01910505948.5)。本研究利用UUO模型，觀察了CPD1對腎纖維化小鼠的治療作用，從病理學(xué)以及分子層面進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，新型PDE5抑制劑CPD1改善腎纖維化的作用可能是通過降低纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)、減少Kim-1介導(dǎo)的腎損傷產(chǎn)生的，但其具體的作用分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探索，本研究對抗腎纖維化新藥的開發(fā)和臨床研究具有重要意義。