RNA去甲基化酶FTO抑制劑對膠質母細胞瘤干細胞功能的影響

吳潤秋，田 聰，張 旭，于如同，

(徐州醫科大學 1.第一臨床學院，2.附屬醫院神經外科，江蘇 徐州 221002)

膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是惡性程度最高的原發性腦腫瘤，但盡管采用手術、放療和化療等綜合療法，其中位生存期仍小于15個月，5年生存率低于6%[1-2]。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是目前GBM化療的一線藥物，能使DNA甲基化導致DNA錯配修復系統失效，最終導致腫瘤細胞的死亡[3]。在GBM中存在膠質母細胞瘤干細胞(glioblastoma stem cells，GSC)亞群，GSC具有高度致瘤、自我更新和多向分化能力。GSC被認為是促使GBM發生、發展、侵襲、抗治療和惡性復發的驅動力，對各種殺傷腫瘤細胞的理化因素不敏感。這提示抑制GSC的自我更新能力和多向分化，能夠減慢腫瘤的進展[4-6]。因此，根除GSC有助于消除GBM的形成與復發，對靶向GBM的治療非常重要。

N6-甲基酰胺(m6A)是真核生物mRNA和非編碼RNA中含量最豐富的內部修飾，對RNA上m6A修飾的精確調控在各種生物和病理過程中發揮著重要作用[7-8]。m6A去甲基化酶(the fat mass and obesity-associated gene，FTO)在調控GBM惡性增殖及維持GSC干性中具有重要作用[4，9]。FB23-2是FTO的選擇性抑制劑，能發揮出良好的抗白血病作用，還可抑制白血病干細胞的自我更新能力[10]。

本研究分析了m6A去甲基化酶FTO抑制劑FB23-2對GSC活性和自我更新能力等功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑人膠質母細胞瘤干細胞GSC1和GSC2從膠質瘤組織中分離獲得，U251及U87細胞均購自中國科學院上海細胞庫。FB23-2(成都華田生物技術有限公司)，TMZ(上海陶術生物科技有限公司，T1178)，均溶于DMSO配成50 mmol·L-1母液；層黏蛋白(美國Corning公司，354232)，BCA試劑盒(上海碧云天生物科技公司，P0010)，細胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8試劑盒，VICMED公司，VC5001L)，EdU試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司，C10310-1)，EGF和bFGF(美國PeproTech公司，96-AF-100-15-100，96-100-18B-100)，Accutase、B27和Neurobasal培養液(美國Gibco公司，A11105-01，GB17504-044，21103-049)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司，556547)。

1.2 主要儀器多功能酶標儀(美國BioTek公司)，電泳槽、電泳儀及ChemiDocTM觸摸成像系統(美國Bio-rad公司)，倒置顯微鏡(IX53)及熒光倒置顯微鏡(IX71+DP721)(日本Olympus公司)，Facs Canto Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 細胞接種到含有20 μg·L-1EGF、20 μg·L-1bFGF、2% B27的Neurobasal培養液中，置于37 ℃ CO2培養箱培養，待GSC長成懸浮球狀態，選取生長合適的GSC用于各類實驗。

1.3.2免疫熒光 提前用5×104μg·L-1的層黏蛋白包被的爬片放置在24孔板內，將干細胞接種在24孔板內，待細胞黏附在爬片后，多聚甲醛固定45 min，0.1% Triton X-100通透20 min，1% BSA封閉2 h，一抗孵育過夜，PBS洗2遍，熒光二抗避光孵育2 h，PBS洗2遍，DAPI染15 min，洗2遍后取出爬片，熒光顯微鏡下拍攝照片。

1.3.3Western blot 使用處于對數生長期的細胞接種6孔板內，約106個細胞，待普通細胞貼壁后收取細胞蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，配平濃度，經SDS-PAGE凝膠電泳后，轉至PVDF膜上，3% BSA室溫封閉2 h，一抗4 ℃搖床過夜孵育，1× TBST洗3遍，每遍10 min，二抗室溫孵育2 h，1× TBST洗3遍，然后顯影。

1.3.4CCK-8實驗 將GSC接種于96孔板，每孔6 000 個細胞，加入不同濃度的FB23-2/TMZ處理72 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，混勻后避光孵育30～60 min，然后使用酶標儀檢測波長450 nm處的吸光值(OD)。每組設3個重復孔。存活率/%=(實驗組OD-空白對照OD)/(對照組OD-空白對照OD)×100%。

1.3.5神經球形成實驗 取直徑大概200 μm的細胞球的GSC，用Accutase常規消化GSC，在96孔板中以1 000個/孔的細胞數接種，每個實驗組均重復3個孔，將不同濃度的FB23-2加入實驗組，混勻培養，每3 d添加50 μL新鮮培養基，繼續培養至7～10 d，本實驗重復3次。

1.3.6EdU參入實驗 將干細胞接種于用5×104μg·L-1的層黏蛋白包被的96孔板內，待細胞貼壁后，加入不同濃度的FB23-2。培養72 h后，用EdU培養基(50 μmol·L-1)孵育2 h，再使用4%多聚甲醛的PBS固定30 min，PBS清洗后，用0.5%的Triton X-100處理10 min。PBS清洗后，用1×Apollo?反應液避光孵育30 min，DAPI染色15 min。PBS清洗3次，最后1次液體留在孔內，在熒光顯微鏡下拍照。

1.3.7流式細胞術檢測細胞凋亡 取直徑大概200 μm的細胞球，用Accutase常規消化，在6孔板中以每孔約1×105個細胞接種，將0.1% DMSO加入對照組，實驗組加入不同濃度的FB23-2藥物，混勻培養，培養72 h后收集細胞，用冰PBS洗滌細胞兩次，用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒染色。流式細胞儀檢測并用流式細胞軟件分析細胞凋亡比例。

2 結果

2.1 GSC鑒定及FTO的表達量檢測CD133和Nestin是鑒定GSC的分子標志物。如Fig 1A所示，GSC1和GSC2均穩定表達CD133和Nestin兩種干細胞標記物。同時，我們檢測了FTO在不同細胞株內的表達情況，Fig 1B顯示，FTO在不同細胞株表達量不同，相對于U251和U87細胞，在GSC細胞內表達更高。說明FTO在GSC中表達較高，可能是潛在的治療靶點。

Fig 1 GSC identification and FTO expression in cells

2.2 FTO抑制劑FB23-2對GSC活性的影響為評估FTO抑制劑FB23-2對膠質瘤干細胞活性的影響，我們使用CCK-8法檢測不同濃度FB23-2及TMZ處理后GSC1、GSC2的細胞活性，如Fig 2結果顯示，GSC對TMZ的敏感性不同，GSC1明顯耐藥，而GSC2較為敏感；而FB23-2能夠有效抑制兩種GSC的活性，且呈濃度依賴性抑制，其IC50分別為7.11 μmol·L-1和4.63 μmol·L-1。

Fig 2 The inhibitory effect of FB23-2 on GSC activity

2.3 FB23-2可抑制GSC克隆形成能力FB23-2/TMZ(4、8 μmol·L-1)處理GSC 7 d后，倒置顯微鏡下觀察神經球的形成情況。如Fig 3顯示，與對照組相比，TMZ對GSC1成球能力的抑制不明顯，但能抑制GSC2神經球的大小和數量；而FB23-2處理組的兩種GSC神經球的大小和數量較對照組明顯減少。這表明FB23-2能明顯抑制膠質瘤干細胞神經球形成能力。

Fig 3 The effect of FB23-2/TMZ on GSC neural sphere formation detected by sphere formation assay(10×)

2.4 FB23-2能夠有效抑制GSC的自我更新能力為進一步評估FB23-2對GSC自我更新的影響，我們采取體外有限稀釋實驗法檢測GSC的自我更新能力。在2、4、8 μmol·L-1濃度的FB23-2處理7 d后，如Fig 4顯示，FB23-2處理組的細胞自我更新能力較對照組顯著降低，且呈濃度依賴性。

Fig 4 Inhibition of GSC self-renewal by FB23-2 analyzed by limited dilution assay in vitro

2.5 FB23-2可抑制GSC的增殖為評估FB23-2對GSC增殖的影響，我們使用EdU 摻入增殖實驗顯示對細胞增殖能力的影響。如Fig 5所示，FB23-2(4、8 μmol·L-1)處理72 h后，熒光顯微觀察顯示，對EdU陽性細胞進行計數，處理組分別為(70.59±13.74)%和(50.33±4.53)%。因此，FB23-2可以明顯抑制膠質瘤干細胞的增殖活性，而且呈劑量依賴性。

Fig 5 Inhibition of GSC proliferation by FB23-2 by EdU method (10×)

2.6 FB23-2誘導GSC的凋亡為評估GSC的凋亡是否受到FB23-2影響，采用流式細胞術檢測4、8 μmol·L-1處理72 h后的GSC。如Fig 6顯示，處理組細胞的凋亡率分別為(12.16±1.90)%、(16.77±1.17)%，這表明FB23-2可誘導GSC的凋亡。

3 討論

GBM是侵襲性最強的腦惡性腫瘤，但目前依然缺乏有效的治療措施[11-12]。目前認為，膠質瘤干細胞的自我更新和無限增殖與腫瘤治療的化療耐藥密切相關的因素之一，耐藥已經成為目前腫瘤化療的難題[13-14]。因此，亟需新型小分子靶向藥物來提高GBM治療療效。在本研究中，我們證明FTO抑制劑FB23-2可調控GSC的細胞活性、成球、自我更新、增殖、以及凋亡功能。

m6A是真核生物中最豐富的內部mRNA修飾，能夠影響各種生物過程，在控制胚胎干細胞多能性和分化中發揮重要的作用[15]。m6A甲基化與包括腫瘤在內的多種疾病的發生密切相關，臨床數據分析顯示與預后和治療策略的制定也緊密相關[16]。m6A甲基化修飾主要是由一個甲基轉移酶復合物來催化，該復合物包含甲基轉移酶樣3(METTL3)、甲基轉移酶樣14(METTL14)和Wilm腫瘤-1相關蛋白(WTAP)。METTL3或METTL14表達的敲除降低m6A mRNA水平，促進GSC在體外的生長和自我更新，促進GSC在體內形成腦腫瘤的能力，過表達METTL3或METTL14或抑制FTO能明顯抑制腫瘤進展并延長GSC移植小鼠的壽命[4，17]。

Fig 6 Effect of FB23-2 on GSC apoptosis analyzed by flow cytometry

FTO被鑒定為第一個使mRNA中的m6A氧化去甲基化的RNA去甲基化酶，參與各種疾病過程[17]。GSC有獨特的m6A RNA甲基化模式，以及對這種細胞狀態特異性甲基化模式的翻譯反應有明顯的差異；FTO識別結合m6A靶標后RNA甲基化峰值丟失，能提高其翻譯效率[18]。FTO抑制劑FB23-2可通過 MYC、CEBPA、RARA和ASB2等FTO下游靶點，顯著抑制白血病干細胞的自我更新能力，表明FTO可能是白血病干細胞中一個潛在的分子靶點，以抑制白血病的發生[10]。本研究表明，抑制FTO能夠有效的抑制GSC的生長、自我更新以及神經球的形成，且有一定劑量依賴性。同時，FB23-2還能抑制GSC的細胞增殖，促進GSC的細胞凋亡。

綜上，FB23-2作為FTO的特異性小分子靶向抑制劑，能夠有效的抑制GSC的生長、自我更新、增殖及凋亡等功能。本研究為FB23-2治療膠質母細胞瘤提供了實驗基礎，靶向FTO可能是清除膠質瘤干細胞的潛在策略。

(致謝：本實驗在徐州醫科大學神經外科實驗室完成，感謝各位老師的幫助。)