苦參堿衍生物ZS10基于PI3K/AKT信號通路誘導人肝癌細胞BEL-7402凋亡

王 湘，張 森，韓科研，曾攀科，李雪嬌，王立升

(廣西大學醫學院，廣西 南寧 530004)

原發性肝癌是人類消化系統最常見的癌癥之一, 在我國為高發癌癥，具有惡性程度高、復發率高、轉移率高的特點[1]。臨床治療多采用手術、放療、化療以及免疫療法。雖然隨著酪氨酸激酶抑制劑的出現，患者的存活率得到了很大改善，但仍然伴有新的問題，如耐藥性問題等[2-3]。因此，研發能夠有效地抑制肝癌細胞增殖和轉移的新型化學藥物，克服其耐藥性，具有重大意義。

AKT是一種在人類癌癥中通常被激活的絲氨酸/蘇氨酸激酶，被認為與細胞增殖、轉移、凋亡和癌變有關[4],PI3K/AKT信號通路通過調節多種與細胞相關的通路，在腫瘤發生中發揮重要作用[5]。AKT激活后，能夠轉移至細胞核和細胞質，同時激活細胞增殖、轉移、周期、凋亡相關靶點，這些機制不是孤立的，可能在腫瘤發生過程中共存。因此，PI3K/AKT可能是肝癌治療的關鍵部位。

苦參堿(Matrine，Fig 1)是豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)、苦豆子(S.alopecuroidesL.)等中草藥活性成分的單體提取物，其化學式為C15H24N2O，具有喹諾里西啶結構。已經上市的復方苦參注射液作為一種抗癌藥物，可與其它抗癌藥物聯合治療肝癌和非小細胞肺癌[3,6-8]。臨床研究表明，將標準療法與苦參堿聯合使用，癌癥患者的生活質量和免疫功能得到了極大的改善[9-10]。由于苦參堿具有良好的溶解性、安全性和柔韌性結構，已被認為是一種理想的先導化合物[11]。苦參堿衍生物ZS10(Fig 1)，具有較好的體外抗腫瘤活性。本文報道了ZS10的合成，以及ZS10對BEL-7402細胞增殖，周期和凋亡的影響，基于PI3K/AKT通路對相關蛋白進行了初步研究，為ZS10進一步開發成為臨床藥物奠定了基礎。

Fig 1 The structural formula of matrine and its derivative ZS10

1 材料

1.1 細胞株人肝癌細胞BEL-7402，人正常肝細胞LO2由廣西中藥藥效研究重點實驗室提供。

1.2 藥品與試劑苦參堿為陜西昂盛生物醫藥公司產品；二氯甲醚、無水四氯化錫、1-氟萘均為薩恩化學技術(上海)有限公司產品；乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷均為廣東汕頭市西隴化工股份有限公司產品；氫化鈉為國藥集團化學試劑有限公司產品，四氫呋喃為成都市科龍化工試劑廠產品；RPMI 1640高糖培養液為美國賽默飛公司生產；胎牛血清為杭州四季青公司產品；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)為美國默克公司產品；蛋白質定量試劑盒(BCA)試劑盒，LDH乳酸脫氫酶試劑盒為上海碧云天生物科技有限公司生產產品；凋亡抑制劑Z-VAD(OH)-FMK(Z-VAD-FMK)(HY-16658)，絲裂霉素購于中國MedChemExpress公司；Cyclin D1、CDK2、EGFR、N-codherin、E-codherin、Vimentin、Bax、Bax、caspase-3、caspase-9為艾博抗(上海)貿易有限公司生產；4%細胞組織固定液(多聚甲醛)為北京索萊寶生物科技有限公司生產；碘化丙啶/核糖核酸酶染色緩沖液(PI/Rnase)細胞周期試劑盒為上海拜力生物科技有限公司生產；膜聯蛋白-V/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)細胞凋亡試劑盒為上海拜力生物科技有限公司生產。

1.3 主要儀器高內涵細胞成像分析系統(美國PerkinElmer公司)；高通量酶標儀篩選系統(美國PerkinElmer公司)；高速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；倒置顯微鏡(OLYMPU奧林巴斯公司)；生物安全柜(Thermo)；細胞計數儀(Bio-Rad公司)；細胞培養箱(德國Binder 公司)；Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher Scientific)。

2 方法

2.1 化學合成將10 g(100 mmol)2,2,2-三氟乙醇和14.3 g(140 mmol)三乙胺溶于無水120 mL乙醚中。在室溫下加入適量17.2 g(90 mmol)甲苯磺酰氯。攪拌混合物約48 h，直到甲苯磺酰氯完全反應。過濾，用30 mL×2乙醚洗滌濾餅。將濾液濃縮。用硅膠柱層析法，正己烷 ∶乙醚=9 ∶1為洗脫劑，得2,2,2-三氟乙基-4-甲基苯磺酸酯。

氮氣保護，將34 g(236 mmol)1-萘酚、40 g(157 mmol)2，2，2-三氟乙基對甲苯磺酸酯、33 g(240 mmol)碳酸鉀和80 mL二甲基亞砜的懸浮液，100 ℃加熱攪拌12 h。冷卻后，加入100 mL水和200 mL甲苯，分離出有機層。有機層用100 mL 5%氫氧化鈉水溶液洗滌5次，再用100 mL水洗滌4次，濃縮得到36 g油狀物質。在真空條件下蒸餾，得28 g 1-(2，2，2-三氟乙氧基)萘，產率76%。

Fig 2 Synthetic route of matrine derivative ZS10

在0 ℃、氮氣保護條件下，7.47 g(65 mmol)1,1-二氯甲醚溶于30 mL二氯甲烷中，緩慢滴加16.94 g(65 mmol)無水四氯化錫，保持0 ℃反應1 h，溶液變為淡黃色，將7.458 g(32.5 mmol)1-(2，2，2-三氟乙氧基)萘溶于20 mL二氯甲烷并注入反應液中，然后反應液從冰浴條件下緩慢加熱至室溫，過夜攪拌，反應結束后加入100 mL冰水，分離出有機相，水洗多次，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得8.86 g粗品，經快速硅膠柱層析純化得8.83 g白色固體，即化合物4-(2,2,2-三氟乙氧基)-1-萘甲醛，產率93%。

于100 mL圓底燒瓶中分別加入2.8 g(116 mmol)氫化鈉、50 mL無水四氫呋喃，攪拌均勻，加入1.24 g(5 mmol)苦參堿，回流，加入2.5 g(10 mmol)4-(2,2,2-三氟乙氧基)-1-萘甲醛，TLC檢測反應至終點。冷卻，用3N的鹽酸調節反應液至中性。20 mL×3二氯甲烷萃取，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，抽濾、濃縮，得黃色油狀物。經硅膠柱層析，V乙酸乙酯 ∶V石油醚=5 ∶4純化得白色粉末固體，即14-[1-(4-三氟乙氧基)萘甲烯基]苦參堿，乙酸乙酯-甲醇重結晶得1.81 g白色粉末，產率44%。

2.2 細胞培養人體肝癌細胞系BEL-7402用RPMI 1640培養基外加10%胎牛血清(Gibco,CA,USA)和1%青霉素/鏈霉素雙抗(Gibco,CA,USA)培養，細胞培養在37 ℃、5% CO2培養箱中。

2.3 MTT法檢測ZS10對細胞增殖-毒性影響取對數生長期BEL-7402細胞，胰酶消化，種于96孔板(1×107·L-1)，每孔加入100 μL培養基，37 ℃孵育24 h，貼壁。設置給ZS10實驗組(有細胞+不同濃度的ZS10)、空白組(不含細胞，用于調零酶標儀)、陰性對照組(有細胞，無ZS10的培養基)、苦參堿對照組(有細胞+不同濃度苦參堿)、陽性藥對照組(有細胞+不同濃度伊替立康)，抑制劑對照組(有細胞+ZS10+Z-VAD-FMK)。設置藥物組濃度均分別為：0、0.5、1、2、4、6、8、16、32、64 μmol·L-1，每個濃度設置3個復孔。分別培養24 h、48 h 和72 h。配制5 g·L-1的MTT溶液，每孔加10 μL MTT孵育4 h。棄上清液，每孔加200 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，酶標儀檢測OD值，重復實驗3次。

抑制率/%=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)]×100%

取對數生長期LO2細胞，同上操作。

2.4 微板法檢測BEL-7402細胞 LDH 釋放率取對數生長期BEL-7402細胞，胰酶消化，種于96孔板(1×108L-1)，孵育24 h后，貼壁，分別加入含濃度為1、2、4、6、8 μmol·L-1ZS10的無血清培養基，置于培養箱中培養48 h后，將細胞分為背景空白對照組、樣品對照組、樣品最大酶活性對照組、給藥組，每組設5個復孔，收集細胞培養液，按照試劑盒說明書進行樣本處理，在450 nm測定LDH吸光度值，進行計算。

2.5 DAPI染色取對數生長期BEL-7402細胞，胰酶消化，種于6孔板(1×108L-1)，37 ℃孵育24 h，貼壁，分別加入含濃度為1、2、4、6、8 μmol·L-1ZS10的培養基，置于培養箱中培養48 h后，吸除培養基，PBS清洗1遍，使用多聚甲醛固定20 min，用PBS清洗2遍，加入DAPI溶液，染色10 min，PBS清洗2遍，采用高內涵細胞成像分析系統進行拍照分析。

2.6 劃痕實驗取對數生長期BEL-7402細胞，胰酶消化，種于6孔板上(5×108L-1)。37 ℃孵育24 h，貼壁。吸棄培養基，用不含胎牛血清的培養基饑餓細胞6 h，用0.5 mg·L-1絲裂霉素處理細胞3 h，用100 μL槍頭均勻于6孔板背面劃痕，寬度一致，PBS清洗3次，用不含胎牛血清的培養基稀釋ZS10。稀釋后的ZS10濃度為：0、1、2、4、6、8 μmol·L-1。給藥后，采用熒光倒置顯微鏡在0 h，24 h、48 h拍照。

2.7 克隆形成實驗取對數生長期BEL-7402細胞，胰酶消化，種于6孔板上(500 mL)，24 h后棄去原培養液，分別加入濃度為1、2、4、6、8 μmol·L-1的ZS10培養基，置于培養箱中培養6 d后，終止培養，棄去培養基，磷酸緩沖液(PBS)清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min后，結晶紫染色，PBS沖洗，室溫風干，采用菌落計數分析系統拍照并計數。

2.8 流式細胞術檢測細胞周期取對數生長期BEL-7402細胞，胰酶消化，種于6孔板上(5×108L-1)。37 ℃孵育24 h，貼壁。胰酶消化成細胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min，盡可能吸盡上清液。PBS吹打洗滌細胞，1 000 r·min-1離心5 min棄上清液，重復2次后，70%乙醇固定，4 ℃放置12 h，1 000 r·min-1離心10 min后棄上清液，PBS清洗并離心2次，棄上清液后加入5 μL的碘化丙啶(PI)染液混勻，避光室溫孵育30 min，采用流式細胞儀進行細胞周期分析。

2.9 流式細胞術檢測細胞凋亡取對數生長期BEL-7402細胞，胰酶消化，種于6孔板上(5×108L-1)。37 ℃孵育24 h，貼壁。經1、2、4、6、8 μmol·L-1ZS10干預48 h后，胰酶消化，1 000 r·min-1離心5 min，收集細胞，棄上清液，加入195 μL染色緩沖液(binding buffer)重懸細胞，5 μL碘化丙啶(PI)，混勻，孵育15 min，采用流式細胞儀進行細胞凋亡分析。

2.10 Western blot檢測ZS10對BEL-7402細胞PI3K/AKT通路及相關蛋白表達水平的影響取對數生長期BEL-7402細胞，胰酶消化，種6孔板上(5×108L-1)。37 ℃孵育24 h，貼壁。胰酶消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加含1% 蛋白酶抑制劑的裂解液吹打，冰上放置30 min，4℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，用蛋白定量法測定蛋白含量。采用濕式轉印法將蛋白轉印到聚偏二氟乙烯膜(95 mA濕轉150 min)，封閉1 h，采用一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h，充分洗膜后，顯色，凝膠成像系統中成像，采用Image Lab軟件對條帶灰度值進行分析，每組重復檢測3次，取平均值。

3 結果

3.1 ZS10化學合成在強堿氫化鈉作用下，苦參堿與4-(2,2,2-三氟乙氧基)-1-萘甲醛在無水四氫呋喃溶液中回流，經縮合、脫水反應制得相應的目標化合物。

m.p.204.5-206.9 ℃;1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ: 8.24(dd, J=7.4, 1.6 Hz,1H), 7.63(dd, J=7.3, 1.7 Hz,1H), 7.53(td, J=7.5, 1.6 Hz,1H), 7.48(td, J=7.4, 1.6 Hz,1H), 7.37(d, J=1.3 Hz,1H), 7.33(d, J=7.5 Hz,1H), 7.00(d, J=7.5 Hz,1H), 5.20～5.04(m,2H), 3.98 (dd, J=12.4, 6.6 Hz,1H), 3.07～2.90(m,4H), 2.19(dtd, J=14.3, 7.1, 1.1 Hz,1H), 2.15～2.03(m,3H), 1.87～1.78(m,1H), 1.72～1.61(m, 4H), 1.56～1.44 (m, 5H), 1.44～1.32(m,1H), 1.18～1.03(m,2H);13C NMR (125 MHz, Common NMR Chloroform-d) δ 172.97, 155.81, 133.98, 133.50, 132.48, 130.08, 129.09, 128.54, 126.80, 126.22, 125.40, 123.55, 109.15, 57.11, 57.04, 56.27, 47.17, 42.39, 35.84, 27.71, 25.84, 23.90, 23.58, 21.78, 21.37。

3.2 ZS10對BEL-7402細胞增殖能力的影響不同濃度ZS10干預24 h、48 h、72 h后，MTT法檢測結果顯示，與空白組比較，ZS10對BEL-7402細胞的增殖具有明顯的抑制作用(P<0.05)。隨著ZS10濃度逐漸增加，其對BEL-7402細胞抑制率也逐漸增加，呈劑量依賴性。MTT結果顯示，ZS10作用于BEL-7402細胞24、48、72 h后，半數抑制濃度(IC50)分別為(17.02±2.25)、(6.62±1.11)、(5.72±0.8) μmol·L-1(Fig 3A)，相比之下，苦參堿作用于BEL-7402細胞24、48、72 h后，半數抑制濃度均遠大于100 μmol·L-1,見Fig 3C。ZS10藥物濃度小于8 μmol·L-1時，與苦參堿相比，ZS10對人正常肝細胞無明顯毒性，見Fig 3B。Z-VAD-FMK是一種泛caspase抑制劑，能夠抑制caspase家族蛋白酶活性，同時阻斷線粒體途徑和死亡受體途徑的凋亡。將抑制劑與ZS10聯合使用作用于BEL-7402細胞，癌細胞活力明顯升高，見Fig 3D。乳酸脫氫酶主要位于細胞質中，其存在于細胞外培養液中可用于檢測細胞膜完整性的破壞。結果表明，不同濃度的ZS10作用于BEL-7402細胞48 h后，LDH釋放呈劑量依賴性,見Fig 3E。

Fig 3 A: Effect of ZS10 on viability of BEL-7402 cells; B: Toxicity of ZS10 on human normal liver LO2 cells; C: Effect of matrine on viability of BEL-7402 cells; D: Effect of combination of ZS10 and Z-VAD-FMK on viability of BEL-7402 cells; E: Cytotoxicity detected by lactate dehydrogenase (LDH) assay (48 h) n=3).*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

由此可得，對苦參堿14位的改造能夠明顯提升抗腫瘤活性，ZS10對BEL-7402細胞的增殖具有明顯的抑制作用，能夠誘導細胞凋亡。

根據上述結果，由于ZS10在48 h和72 h的IC50相差不大，藥物濃度超過8 μmol·L-1時，對人正常肝細胞具有毒性，綜合考慮，為確保ZS10對肝癌細胞增殖有抑制作用且對正常肝細胞無毒，ZS10給藥時間選擇48 h,藥物濃度選擇0、1、2、4、6、8 μmol·L-1進行后續實驗。

3.3 ZS10對BEL-7402細胞的形態學變化的影響DAPI染色實驗結果表明，ZS10干預BEL-7402細胞24 h后，隨著ZS10濃度的增加，顯示與凋亡相關的明顯形態學改變，細胞核大小不一，核固縮，染色質凝聚成團，進一步導致死亡，見Fig 4。

Fig 4 Effect of ZS10 on morphology of BEL-7402 cells(×40)

3.4 ZS10對肝癌細胞BEL-7402遷移能力的影響細胞劃痕實驗結果表明，ZS10能明顯抑制BEL-7402細胞的遷移，呈現出濃度依賴性。與空白組相比，在24 h和48 h，各實驗組BEL-7402細胞的遷移能力均明顯下降。

Western blot實驗結果表明，ZS10能明顯下調N-cadherin、Vimentin和EGFR蛋白的表達，并同時明顯上調E-cadherin蛋白的表達，且呈濃度依賴性，見Fig 5。

Fig 5 Effect of ZS10 on migration ability of BEL-7402 cells n=3)

3.5 ZS10對BEL-7402細胞克隆形成的影響克隆形成實驗結果表明, 隨著ZS10給藥濃度的增加, BEL-7402細胞的集落形成數量逐漸減少，呈劑量依賴性。與空白組相比，各實驗組BEL-7402細胞的集落形成數量均明顯下降，見Fig 6。

Fig 6 Colony formation of BEL-7402 cells inhibited by ZS10 ( n=3)**P<0.01 vs control group.

3.6 細胞周期實驗經ZS10處理的BEL-7402細胞，與空白組相比，細胞周期S期比例明顯增加，G2期明顯下降。ZS10處理24 h后，隨著ZS10的濃度逐漸增加，細胞周期發生明顯變化，G0/G1期的細胞比例基本保持不變，S期的細胞比例從(37.27±1.54)%增加至(50.49±0.76)%，G2/M期細胞比例從(25.66±0.67)%減少至(12.1±0.55)%。

采用Western blot檢測參與S期阻滯的調控因子，ZS10能明顯抑制周期相關蛋白Cyclin D1和CDK2的表達，且呈現出濃度依賴性，見Fig 7。

Fig 7 Effect of ZS10 on cell cycle distribution arrest of BEL-7402 cells ( n=3)

3.7 細胞凋亡實驗分別取0、1、2、4、6、8 μmol·L-1ZS10給藥48 h，BEL-7402細胞的凋亡率由(3.451±0.316)%明顯增加至(50.16±2.1)%，處于早期凋亡的細胞比率明顯增加為(17.1±1.4)%。根據實驗結果顯示，ZS10能夠在BEL-7402細胞內誘發細胞凋亡，并且隨著ZS10作用濃度的增加，細胞凋亡的比例也明顯增加。

Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，ZS10下調了BEL-7402細胞中PI3K、AKT、P-AKT，以及抗凋亡Bcl-2蛋白，上調了BEL-7402細胞中促凋亡蛋白Bax、caspase-3、caspase-9蛋白的表達(P值均<0.05)，見Fig 8。

Fig 8 Effect of ZS10 on cell apoptosis of BEL-7402 cells n=3)

4 討論

本實驗室選用2,2,2-三氟乙醇和甲苯磺酰氯為起始原料，參考文獻中的方法，成功合成了4-(2,2,2-三氟乙氧基)-1-萘甲醛，收率較高。進一步與苦參堿反應，得到苦參堿衍生物ZS10。最后一步反應需要在保證無水的條件下才有利于反應發生。另外，回流溫度有利于提高收率。ZS10中含有三氟乙氧基，使化合物脂溶性大大增強。同時，經MTT實驗驗證，ZS10明顯抑制BEL-7402細胞增殖,且對正常肝細胞無明顯毒性。

肝癌死亡率高的主要原因是肝癌細胞的轉移，細胞遷移能力可反映癌細胞在體內的轉移能力。劃痕實驗是在體外考察細胞遷移運動能力最經典的實驗之一，采用劃痕實驗考察了ZS10對BEL-7402細胞遷移能力的影響(Fig 5A)，ZS10明顯抑制BEL-7402細胞的遷移。采用Western blot實驗考察ZS10對BEL-7402細胞上皮間質轉化(epithelial-mes-enchymalt transition, EMT)過程的影響，研究結果表明，在肝癌患者中，上皮表型標志蛋白E-cadherin 低表達，而間質表型標志蛋白N-cadherin高表達，這與肝癌的預后效果不佳密切相關(Fig 5C)，ZS10抑制PI3K、AKT、p-AKT、N-cadherin以及Vimentin的表達，且呈劑量依賴性，同時抑制EGFR的表達，并促進E-cadherin的表達，從而抑制細胞遷移。

細胞周期與細胞增殖密切相關，S期是細胞DNA合成的關鍵時期，S期阻滯可使細胞增殖周期延長，增殖速度減慢。實驗結果顯示，與空白組相比，ZS10使BEL-7402細胞周期S期明顯增加，G2/M期細胞相應減少，誘導S期阻滯。因此，ZS10抑制BEL-7402細胞增殖的機制之一可能是延長細胞周期。在癌細胞增殖中，PI3K激活AKT信號通路，調控G1，G2細胞周期進展和Cyclin D1的表達，促進癌細胞生長[12]。細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)與相應的細胞周期蛋白復合物參與細胞周期進展。Cyclin D1和CDK2作為細胞周期調節因子[13]，Cyclin D1在多種腫瘤細胞中都呈現過度表達,是多種人類原發性腫瘤的特征之一，具有重要的參考意義。ZS10能夠抑制AKT、p-AKT、Cyclin D1和CDK2表達，呈濃度依賴性下調，進而調節癌細胞周期，誘導BEL-7402細胞S期阻滯。

AKT的磷酸化可以調控Bax、Bcl-2蛋白表達，Bax和Bcl-2是細胞凋亡的主要調控蛋白之一[14]，據報道，Bcl-2可自制細胞色素C釋放到胞質中，并與其同源物一起維持線粒體膜的完整性[15]，在細胞內二者通常以二聚體形式發揮作用[16]，通過二者比值，可以判斷細胞凋亡狀態。比值升高導致線粒體外孔膜形成，細胞色素C釋放進入胞質，和Apaf-1形成凋亡體，激活caspase-3和caspase-9,導致細胞死亡[17]。caspase蛋白酶家族在細胞凋亡中起到重要作用。其中caspase-3和caspase-9的激活與細胞凋亡密切相關。

實驗結果表明，隨著ZS10給藥濃度的升高，PI3K、AKT、P-AKT以及抗凋亡蛋白Bcl-2表達均下調，促凋亡蛋白Bax表達上調，同時，其下游的caspase-3和caspase-9表達也上調，Bax/Bcl-2比值升高，說明PI3K/AKT通路在ZS10誘導細胞凋亡中發揮重要作用。

與未使用抑制劑的ZS10組對比，將Z-VAD-FMK與ZS10共同作用于BEL-7402細胞，細胞依舊存在增殖抑制現象，然而，ZS10濃度低于8μmol/L時，對人正常肝細胞未見明顯毒性，推測原因可能是Z-VAD-FMK抑制了與caspase相關通路的BEL-7402細胞的凋亡，但是，ZS10可能同時作用于多條信號通路，誘導BEL-7402細胞凋亡。

在本研究中，合成了一種苦參堿衍生物ZS10，該化合物在體外明顯抑制肝癌細胞的增殖(Fig 3～5)，基于PI3K/AKT通路誘導BEL-7402細胞凋亡并阻滯S期，為該化合物進一步開發成治療肝癌的藥物提供了實驗依據，但ZS10可能對多條信號通路具有明顯作用，抑制BEL-7402細胞增殖，誘導細胞凋亡，這需要進一步的研究證實。