G蛋白偶聯雌激素受體抑制劑增加他莫昔芬誘導T-47DTR耐藥細胞凋亡

張敏琴，宋雨萱，樊雙琴，任 爽，張 玥，陳 妍，沈祥春，劉同征，張 敏

(貴州醫科大學 1.基礎醫學院生理學教研室、2.天然藥物資源優效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.暨南大學腫瘤藥理研究所，廣東 廣州 510632)

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤[1]。約70%為雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性，抗雌激素的內分泌治療是該類患者主要的治療手段[2]。作為最有效和最常用的抗雌激素藥物，他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)已被證實可大大延長乳腺癌患者的生存期[3]。盡管大多數患者從這種治療中獲益，但臨床數據顯示，大約50%的患者對他莫昔芬產生耐藥性，最終導致復發和死亡[4]。

G蛋白偶聯雌激素受體(G-protein coupled estrogen receptor，GPER)，又稱GPR30，在結構上不同于經典的ERα和ERβ，是一種新型雌激素受體，介導多種雌激素反應[5]，并在獲得性他莫昔芬耐藥中起重要作用。據有關文獻報道，他莫昔芬對GPER具有激動作用，體內外研究數據表明，GPER的表達與他莫昔芬耐藥密切相關[6]，同時也是影響他莫昔芬治療過程的一個不利生存因素。G15是一種取代的二氫喹啉類似物，可抑制GPER，有望應用于增加他莫昔芬耐藥細胞敏感性[7]。因此，本研究探討GPER抑制劑G15能否增加TAM對T-47DTR耐藥細胞誘導凋亡的作用，恢復耐藥細胞對他莫昔芬的敏感性，為抑制GPER增加耐藥細胞對治療藥物敏感性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑人乳腺癌他莫昔芬耐藥細胞株T47D Tam1(CRL-3436TM，T-47DTR)購自美國ATCC公司，人乳腺癌T-47D細胞株購于中國科學院昆明細胞庫。高糖DMEM培養基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)。4-OHT(Cat#ab143638)購自Abcam公司，G15(Cat#14673)購自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒(Cat#23227)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；細胞膜蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒(Cat#P0033)購自碧云天生物技術有限公司。MTT粉末(Cat#M8180)購自北京索萊寶公司。caspase-9/p35/p10單克隆抗體(Cat#66169-1-Ig)，caspase-3/p17/p19單克隆抗體(Cat#66470-2-Ig)，BAX 多克隆抗體(Cat#50599-2-Ig)，Bcl2多克隆抗體(Cat#26593-1-AP)抗體均購自proteintech公司；Na+,K+-ATPase α1(Y10)多克隆抗體(BS1436)，β-actin(4D3)單克隆抗體-HRP(Cat#BS6007M)，羊抗鼠 IgG(H+L)HRP(Cat#BS12478)，羊抗兔 IgG(H+L)HRP(Cat#BS13278)抗體均購自Bio-World公司；GPER多克隆抗體(Cat#PA5-28647)購自美國Invitrogen公司。

1.2 主要儀器3111二氧化碳培養箱(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；ACEA NovoCyte 3008流式細胞儀(美國艾森公司)；Microfuge?20R冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)；ELX800酶標儀(美國BioTek公司)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 T47D Tam1(T-47DTR)細胞系按照ATCC的標準方案進行培養，在培養基中補充1 μmol·L-14-OHT以維持他莫昔芬的耐藥性。其中T-47DTR使用含有10%胎牛血清(FBS)和10 mg·L-1胰島素的DMEM培養液培養。T47D細胞系在添加10% FBS的DMEM中培養。所有細胞均在5% CO2和37 ℃條件下培養。

1.3.2MTT法檢測細胞存活率 取對數生長期T-47D/TR耐藥細胞或其親本細胞T-47D,按照8×103個/孔接種于96空板內，培養24 h后，給予不同濃度4-OHT(0.5、1、2.5、5、10 μmol·L-1)作用48 h，另設陰性對照(Control組)，每組5個復孔。然后將MTT溶液(5 g·L-1，20 μL)添加到每個孔中并再孵育4 h。然后除去培養基，加入DMSO(100 μL/孔)并充分混合。使用酶標儀在570 nm處測量吸光度(OD)值。重復3次，將所得數據進行計算，得出各濃度藥物下的抑制率(inhibition rate，IR)，IR/%=[(OD對照組-OD4-OHT)/OD對照組]×100%。

1.3.3Western blot檢測蛋白表達 取對數生長期T-47DTR耐藥細胞接種于6孔板內，按照實驗分組T-47DTR、T-47DTR+4-OHT(2 μmol·L-1)、T-47DTR+G15(5 μmol·L-1)和T-47DTR+4-OHT(2 μmol·L-1)+G15(5 μmol·L-1)給藥48 h后。使用含有PMSF(1 mmol·L-1)和蛋白酶抑制劑混合物(1 ∶100)的裂解緩沖液提取細胞總蛋白，離心并收集上清，采用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。按照45 μɡ共20 μL分裝各組蛋白并進行電泳，濕法轉膜，2%牛血清白蛋白封閉。封閉完成后，根據抗體說明書稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，再加入相應二抗室溫孵育90 min，采用Bio-Rad凝膠成像系統獲取圖像，并使用Image Lab分析軟件計算蛋白印跡結果的灰度值。

1.3.4細胞凋亡檢測 取對數生長期T-47DTR耐藥細胞接種于6孔板內，按“1.3.3”項給藥48 h后，用不含EDTA胰酶消化收集細胞，PBS洗滌細胞兩次，2 000 r·min-1，5 min收集1×105細胞，進行FITC/PI雙染，室溫避光反應15 min后進行流式細胞儀檢測。

1.3.5膜漿分離分析 根據試劑盒說明書方法，分離細胞膜蛋白和細胞質蛋白，通過Western blot定量分析GPR30在細胞內分布的變化。

1.3.6統計學處理 所有結果均表示為至少3個獨立實驗的平均值±標準差。使用t檢驗分析兩組之間的差異，并使用單因素方差分析分析多組之間的差異。

2 結果

2.1 4-OHT對T-47D和T-47DTR細胞生長抑制的影響MTT結果顯示，不同濃度4-OHT(0.5、1、2.5、5、10 μmol·L-1)作用48 h后，與T-47D親本細胞相比，T-47DTR耐藥細胞對4-OHT的抵抗性明顯增強，其4-OHT對T-47D和T-47DTR細胞的IC50值分別為(2.69±0.16)μmol·L-1、(26.65±0.03)μmol·L-1，兩者比較差異具有統計學意義(Fig 1)。

Fig 1 Effect of 4-OHT on growth inhibition of *P<0.05，**P<0.01 vs T-47D/TR

2.2 G15對T-47DTR細胞中GPER蛋白表達的影響如Fig 2所示，與T-47D親本細胞相比，T-47DTR耐藥細胞中GPER蛋白表達明顯上調；在T-47DTR耐藥細胞中，給予4-OHT作用48 h后，與空白對照組比較，GPER在細胞膜內易位增加，給予G15處理后能明顯降低4-OHT誘導的T-47DTR細胞中GPER蛋白表達上調(Fig 3)。

Fig 2 Expression of GPER protein in T-47D and

Fig 3 Effect of G15 on GPER protein expression of

2.3 G15誘導T-47DTR耐藥細胞凋亡與單用4-OHT組或對照組相比，4-OHT聯用G15組總凋亡率增加，表明G15可增強4-OHT對T-47DTR細胞的抑制作用(Fig 4)，結果提示，G15能夠增加T-47DTR耐藥細胞對他莫昔芬的敏感性。

Fig 4 Apoptosis in T-47DTR cells induced by

2.4 G15對T-47DTR耐藥細胞中凋亡相關蛋白表達的影響Western blot結果顯示，與單用4-OHT組或對照組相比，4-OHT聯用G15處理48 h后，T-47DTR耐藥細胞中Bax表達顯著增加，Bcl-2表達顯著降低；cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9表達增加(Fig 5)。表明G15影響凋亡相關蛋白的表達從而恢復T-47DTR耐藥細胞對他莫昔芬的敏感性。

Fig 5 Effect of G15 on expression of apoptosis-related

3 討論

他莫昔芬是一種選擇性雌激素受體(ER)調節劑，是世界范圍內ER陽性轉移性乳腺癌女性最常見的內分泌治療藥物，或作為疾病早期的輔助治療藥物，雖然極大地提高了患者生存率，但并非所有患者都能從其使用中獲益[8]。在治療過程中，原發性或獲得性耐藥經常出現，并成為乳腺癌內分泌治療的主要障礙[9]，因此，迫切需要探索新的治療策略，通過克服乳腺癌細胞的耐藥性來提高TAM的療效。

GPER是一種新的膜結合雌激素受體，約在50%的乳腺癌患者中表達，并被認為可以在乳腺癌細胞[10]中介導雌激素的快速效應。在長期使用他莫昔芬治療的過程中可導致耐藥的發生以及GPER的激活[11-13]，這與細胞表面GPER的表達增加有關，導致與生長因子受體的串擾增加，并導致細胞增殖增加[14-16]。同樣，與我們上述觀察到的結果一致，GPER在TAM耐藥細胞中表達明顯高于其親本細胞，表明TAM耐藥細胞中GPER被激活，以及GPER的膜易位在4-OHT處理后在TAM耐藥細胞中增加。提示，GPER受體在TAM治療的過程中起著關鍵作用。然而，目前，并未有針對GPER的藥物上市。因此，本研究探討GPER特異性抑制劑G15誘導T-47DTR耐藥細胞凋亡，恢復耐藥細胞對他莫昔芬的敏感性。首先，我們檢測了T-47DTR耐藥細胞中4-OHT聯用G15對T-47DTR耐藥細胞中GPER蛋白表達的影響。結果顯示，給予G15可顯著減少GPER的表達，與單用4-OHT或對照組相比4-OHT聯用G15顯著減少GPER表達。

已有研究表明，在TAM耐藥的乳腺癌細胞中，GPER通過激活MAPK/ERK-TRIM2信號減少Bim(僅BH3促凋亡蛋白家族成員BCL2-L11)，從而減少TAM誘導的凋亡，促進ER陽性乳腺癌細胞中的他莫昔芬耐藥性[17]。與上述研究結果相似，本研究結果顯示，聯用G15能夠增加4-OHT誘導T-47DTR耐藥細胞發生凋亡，上調凋亡相關蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9的活性，下調抗凋亡蛋白Bcl-2，表明G15可增強T-47DTR對他莫昔芬的敏感性。

綜上所述，本研究表明G15通過抑制GPER的表達影響T-47DTR耐藥細胞凋亡，恢復其對他莫昔芬的敏感性，GPER受體抑制劑G15有望作為耐藥增敏劑應用于臨床腫瘤耐藥患者的治療。