人尿激肽原酶對SAMP8小鼠模型認知功能的影響及機制

王智亮，趙 莉，李 靖，高世超，張躍其

(濰坊市人民醫院 1.藥物臨床研究中心、2.疼痛科，山東 濰坊 261000；3.紐約州立大學布法羅分校藥理系，紐約州 布法羅 14214；4.濰坊市人民醫院神經內科，山東 濰坊 261000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種神經退行性疾病，是老年人群中導致癡呆的主要原因。超過95%的AD患者是散發性AD(sporadic AD，SAD)[1]。隨著我國醫療條件的改善，老年人口比例的上升，SAD患者逐年增多。目前AD尚無有效的治療方法，因此，針對SAD的治療研究日顯重要和緊迫。針對SAD的藥物治療研究中，動物模型是藥物篩選的重要工具，SAMP8小鼠是目前公認的非轉基因癡呆模型[2]。本課題組前期發現，8月齡SAMP8小鼠海馬神經炎性斑、細胞外β淀粉樣蛋白42(Aβ42)、p181-Tau增多，認知功能明顯下降，證實SAMP8小鼠可作為SAD理想的動物模型[3]。

人尿激肽原酶(human urinary kallidinogenase，HUK)是激肽釋放酶—激肽系統的調節物質，能選擇性擴張腦細小動脈，減輕炎性反應及氧化應激水平，促進小血管生成，并減少神經元及神經膠質細胞凋亡[4]。已有研究報道，HUK可改善大鼠腦缺血再灌注后空間學習記憶能力[5]，而記憶能力下降與突觸可塑性密切相關，但目前尚無關于HUK對SAD中認知能力影響及突觸相關蛋白的研究報道。本研究通過觀察SAMP8小鼠給予HUK干預后的行為學及腦組織蛋白改變，探討HUK對SAD模型認知功能的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料8月齡♂SAMP8小鼠和SAMR1小鼠購自山東大學實驗動物中心[SCXK(魯) 2019 - 0001]，動物實驗遵循動物實驗倫理要求。HUK購自廣東天普生化醫藥股份有限公司(0.15PNAU/瓶，粉針劑)。膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransterase，ChAT)購自Mlillipore公司，稀釋度為1 ∶100，二抗為羊抗免IgG，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒購自江蘇碧云天生物科技有限公司；MPO檢測盒購自南京建成生物工程研究所，引物由上海生工公司構建。RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒、RtPCR擴增試劑盒購自上海吉凱基因技術有限公司。PSD95、BDNF抗體購自Abcam公司。SYN、pCREB抗體購自Cell Signaling公司。Morris水迷宮購自北京大學醫學部神科所。冰凍切片機購自德國Leica公司。

1.2 試驗方法

1.2.1動物分組及給藥 未處理的SAMR1小鼠作為對照組(SAMR1組)。SAMP8鼠隨機分為5組：SAMP8組、治療組(分別給予8.75×10-3、1.75×10-2、3.5×10-2、7.0×10-2PNAU·kg-1尿激肽原酶，對應a、b、c、d組)，每組10只，每日同一時間(9 ∶00 am)舌下靜脈注射0.9%氯化鈉溶液稀釋的HUK，氯化鈉量以1 mL·kg-1計。SAMR1組和SMAP8組均給予0.9%氯化鈉溶液1 mL·kg-1，1次/日，給藥共7 d，給藥結束后進行行為學實驗。

1.2.2Morris水迷宮實驗 每日游泳5次，每次60 s，記錄小鼠逃避潛伏期。若小鼠在60 s內未找到平臺，則引導至目標平臺停留5 s，觀察周圍環境。實驗歷時6 d。d 7撤掉平臺，選擇象限I為入水點，水中游泳60 s，記錄動物在目標象限(target quadrant)的游泳時間、穿越平臺次數(passing times)。

1.2.3組織標本制備 水迷宮結束后各組小鼠進行腹腔注射麻醉，暴露心臟后向左心室內注射1%肝素鈉0.2 mL，經左心室行主動脈插管，剪開右心耳后以生理鹽水沖洗血管，再以含4%多聚甲醛的0.01 mol·L-1PBS(4 ℃，pH 7.40)250 mL灌注固定，之后取材。留取一側腦組織行PCR檢測，另一側腦組織放于多聚甲醛中固定，經脫水、石蠟包埋、切片后，進行免疫組化顯色。

1.2.4免疫組化檢測 免疫組化測定海馬組織CA3區ChAT表達。取海馬組織切片，脫蠟水化，室溫孵育10 min，PBS沖洗后以1% BSA+0.4% PBST封閉1 h，加入兔源多克隆抗ChAT抗體，37 ℃孵育1 h。PBS沖洗后加入羊抗兔的二抗，室溫孵育1 h；PBS沖洗后滴加辣根酶標記生物素，孵育20 min后PBS沖洗，行DAB增強顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。熒光顯微鏡下觀察CA3區視野。

1.2.5RT-PCR檢測 提取總RNA，逆轉錄cDNA。使用ChAT基因引物進行逆轉錄。引物序列：上游：5′-GGTGGCCCAGAAGAGCAGTATC-3′，下游：5′-ATTGGAGGCAGGCGTTCATC-3′。PCR循環條件為：94 ℃預變性3 m，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸1 m后進行36個循環，進行融解曲線分析引物的特異性。相對定量2-△△Ct法比較各組間表達差異。

1.2.6MPO活性及IL-1β、IL-18含量測定 各組中任取5只大鼠，取腦組織后剝離海馬，以生理鹽水制成10%的組織勻漿，取0.5 mL的組織勻漿，按照試劑說明書，采用分光光度計比色法用于測定髓過氧化物酶(MPO)活性，以每克腦組織所含酶活力單位(U)表示(U·g-1)。另取0.5 mL腦組織勻漿，4 ℃離心10 min后取上清液，按照說明書步驟分別用IL-1β、IL-18試劑盒檢測組織IL-1β、IL-18含量。

1.2.7Western blot檢測 突觸相關的學習記憶蛋白表達腦組織中加入裂解液(1 mL·mg-1)，勻漿后離心(4 ℃下，10 min)。加入2×緩沖液后煮沸5 min。每孔上樣100 μg后進行電泳(30 mA)分離蛋白質后以PVDF膜轉膜40 min，使用5%脫脂牛奶進行封閉，室溫勻搖2 h，將膜于PSD95一抗(1 ∶600)、SYN一抗(1 ∶800)、BDNF(1 ∶1 000)、pCREB(1 ∶500)于4 ℃孵育過夜，HRP標記二抗孵育1 h，經漂洗后加入ECL發光劑。化學發光分析儀拍照后用ImageJ軟件進行半定量分析。

2 結果

2.1 各組小鼠空間認知功能進行水迷宮測試前，各組間小鼠體質量差異無顯著性(P>0.05)。進行空間探索實驗后，相較于SAMR1組，SAMP8組小鼠的平臺穿梭次數減少(P<0.05)，在的目的象限內探索時間短(P<0.05)，游泳軌跡紊亂盲目，多采為邊緣及隨機軌跡。而給予8.75×10-3、1.75×10-2、3.5×10-2、7.0×10-2PNAU·kg-1不同劑量HUK后，平臺穿梭次數較SAMP8組增多(P<0.05或P<0.01)，在目的象限內探索時間短(P<0.05或P<0.01)，游泳軌跡目的性強(Fig 1 A～C)。以上結果說明，給予HUK處理后，SAMP8小鼠空間探索能力得到明顯提高，空間記憶能力改善。我們以7.0×10-2PNAU·kg-1劑量的d組(HUK組)進行后續實驗。

Fig 1 Spatial cognitive function of mice in each group detected by water maze test

2.2 HUK對SAMP8小鼠CA3區ChAT表達的影響免疫組化染色可見ChAT呈胞質胞膜染色，相較于SAMR1組，SAMP8組ChAT陽性細胞在CA3區表達明顯減少；而HUK組ChAT陽性細胞在CA3區表達明顯增多(Fig 2A)。隨后，我們對各組ChAT的表達進行了rtPCR檢測，SAMP8組表達明顯低于SAMR1組(P<0.01)，而給予HUK治療后，ChAT表達明顯高于SAMP8組(P<0.01)，見Fig 2B。

Fig 2 Spatial cognition of each group detected by water maze test(× 400)

2.3 HUK對氧化應激水平的影響由Fig 3可見，與SAMR1組比較，SAMP8組小鼠CA3區中IL-1β、IL-18含量及MPO活性明顯升高(P<0.01)。與SAMP8組比較，HUK明顯降低小鼠CA3中IL-1β、IL-18含量及MPO活性(P<0.01)。以上結果提示HUK能降低SAMP8小鼠中氧化應激水平。

Fig 3 Effect of HUK on level of oxidative stress##P<0.01 vs SAMR1 group; **P<0.01 vs SAMP8 group.

2.4 HUK對SAMP8小鼠突觸相關蛋白表達的影響為進一步驗證HUK能否改善SAMP8小鼠的突觸可塑性，我們采用Western blot法檢測了CA3區突觸相關蛋白PSD95和SYN。與SAMP8小鼠比，SAMR1小鼠PSD95和SYN蛋白表達量均低(P<0.01)；而經HUK干預7 d后，PSD95和SYN蛋白的表達均增加(P<0.01)，見Fig 4。本部分結果表明HUK改善了SAMP8小鼠海馬突觸可塑性。

Fig 4 Effect of HUK on expression of synapse-related proteins ##P<0.01 vs SAMR1 group; **P<0.01 vs SAMP8 group.

2.5 HUK對pCREB-BDNF信號通路的影響Western blot分析顯示，與SAMR1組相比，SAMP8小鼠BNDF和pCREB水平明顯降低(P<0.01)。而SAMP8小鼠經HUK處理后，BNDF和pCREB水平顯著增加(P<0.01)。見Fig 5。以上結果表明HUK增強了SAMP8小鼠海馬中的pCREB/BDNF信號傳導，這可能是HUK保護突觸可塑性的潛在機制。

Fig 5 Effect of HUK on pCREB-BDNF signaling pathway##P<0.01 vs SAMR1 group; **P<0.01 vs SAMP8 group.

3 討論

本研究表明，HUK能明顯改善8月齡SAMP8小鼠的空間認知功能，HUK提高了SAMP8小鼠CA3區ChAT的表達，并且HUK能減輕小鼠腦組織中氧化應激水平，促進突觸相關蛋白的表達。

近年來研究發現，HUK具有多方面的藥理活性，能夠減弱氧化應激和炎癥反應，減少神經元凋亡，并保護瀕臨壞死的神經元[4-5]。臨床研究證實，HUK能夠減輕神經功能損傷，促進腦組織修復能力，促進神經營養因子的表達，具有潛在的改善認知功能作用[4]。但目前尚無關于HUK與SAD模型中神經元細胞ChAT、突觸蛋白表達的研究報道。

AD的標志性病理學改變包括：由Aβ構成的淀粉樣炎性斑塊、Tau蛋白過度磷酸化構成的神經原纖維纏結。少部分AD患者與Aβ前體蛋白和早老素1、2基因突變有關，大多數AD患者呈散發性，與突變基因無關聯。SAD的多種致病因素可能最終導致Aβ的瀑布效應，意味著在Aβ形成之前SAD患者存在其他形式病理改變[6]。乙酰膽堿是中樞神經系統最重要的神經遞質之一，在學習記憶中起重要作用。膽堿乙酰轉移酶(ChAT)為乙酰膽堿生成的限速酶。AD患者多處腦區ChAT活性降低，表達量減少，與患者癡呆程度、腦內Aβ含量呈負相關。

SAMP8小鼠模型是由AKR/J小鼠品系基于自然衰老篩選而來的快速老化模型，未經基因突變修飾，表現出記憶力和學習能力的迅速惡化[7-8]。SAMP8小鼠具有AD早期的多種特征，例如神經元和樹突棘的喪失、膽堿能缺陷、氧化應激增加等[3，7]，因此，SAMP8是進行SAD研究的良好動物模型。本研究中，SAMP8小鼠空間認知能力較SAMR1小鼠明顯下降，并且出現ChAT減少、氧化應激水平增加，進一步證實了以上結論。AD發病機制中的一個關鍵環節是促炎細胞因子增加為特征的神經炎性相關氧化應激過程，IL-1β和IL-18介導谷氨酸興奮毒性與氧化應激反應，導致神經細胞死亡。IL-1β和IL-18參與了神經損傷后炎性小體介導的氧化應激作用，去氧化狀態后，IL-1β、IL-18、cleaved-caspase-1和MPO表達降低[9-10]，而氧化應激還可進一步增加IL-1β和IL-18的產生[11]。Corbo等[12]最新研究表明，白細胞端粒長度和IL-1β和IL-18是認知障礙轉變為AD的新型標志物，AD不僅是神經退行性疾病，而且是具有加速氧化應激水平的“全身”疾病。AD患者及動物模型中氧化應激水平增高，而神經元內氧化應激會導致突觸減少及樹突棘丟失[13]。在1-2月齡APP/PS1小鼠中Aβ斑周圍存在較強氧化應激水平，而突觸明顯減少，在3xTg-AD小鼠的研究中發現海馬區域明顯氧化應激水平，海馬神經元傳遞信號級聯降低，并影響突觸可塑性[14-15]。

膽堿能神經元主要分布于海馬CA3區，而海馬CA3區與學習及記憶密切相關，CA3區損傷會出現學習和記憶功能障礙。研究顯示SAD患者CA3區出現明顯增齡性退變[16]。海馬區突觸相關蛋白也參與了學習記憶過程，突觸素(SYN)是突觸前末端標記物，而突觸后密度蛋白95(PSD95)則是突觸后末端標記物。除了神經營養功能外，腦源性神經營養因子(BDNF)還可以有效調節突觸可塑性、學習和記憶。突觸蛋白的表達和活性通過BDNF來調節，海馬中SYN和PSD95的表達會通過增強的BDNF信號傳導而增加[17]，而BDNF的神經保護作用則依賴于磷酸化轉錄因子環磷腺苷反應元件結合蛋(pCREB)介導的轉錄[18]。本研究中，SAMP8小鼠突觸相關蛋白及BDNF、pCREB均減少，與上述研究結果相一致。

綜上，本研究證明HUK具有提高SAD動物模型認知功能的作用，能改善CA3區神經元功能，其機制可能通過促進CA3區ChAT表達、減輕氧化應激水平及增加突觸相關蛋白表達來實現。由此初步闡明HUK具有潛在的AD治療效果。在以后的工作中，我們還將繼續通過體外細胞實驗，以進一步闡明HUK的分子作用機制。