高原低氧條件下紅景天苷對小鼠記憶損傷的保護作用

秦寧寧，申亦可，程俊飛，張曉靜，李文斌，王 榮

(1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院藥劑科，甘肅 蘭州 730050)

高海拔地區低壓低氧的環境會造成記憶障礙、睡眠障礙、情緒障礙等與腦功能相關的影響[1-3]。低壓低氧引起的記憶損傷通常與活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生、神經遞質及調節劑水平的變化、海馬神經變性等有關。目前，雖然已經充分證明不同海拔高度和持續時間對記憶功能有不同程度的損害，但卻尚未開發出廣泛有效的藥物來改善這種損傷。目前常用的治療高原低氧損傷的藥物主要有乙酰唑胺、地塞米松等，但由于其存在副作用，不建議用于預防[4]。因此，在高原低氧條件下評估以尋找對記憶損傷有效的預防藥物具有重要意義。

紅景天苷是紅景天屬藥用植物的主要活性成分，已被證實具有抗癌、抗氧化及神經保護作用[5-7]。但是對于紅景天苷神經保護作用過程中所涉及的作用機制還有太多的不明確關系，其研究尚停留在實驗基礎階段。在本研究中，我們旨在評估紅景天苷是否能夠改善高原低氧造成的小鼠記憶障礙，并進一步探討了紅景天苷是否通過減輕氧化應激損傷、調節神經遞質水平及減少神經元凋亡來改善高原低氧造成的記憶損傷。

1 儀器與材料

SPF級C57BL/6J小鼠，♂，體質量(20±2) g，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供[實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0010]。

紅景天苷(寶雞晨光生物，批號：HS181211S1，純度≥98%)；SOD試劑盒(批號：20210819)、MDA測定試劑盒(批號：20210628)、GSH測試盒(批號：20210819)、H2O2測試盒(批號：20210625)、谷氨酸測試盒(批號：20210926)、A-CHE測試盒(批號：20210712)均購自南京建成生物工程研究所。Bax、caspase-3、Grin1抗體，辣根過氧化物酶(horse reddish peroxidase，HRP)標記二抗均購自proteintech公司。

Panlab水迷宮(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；MDF-U2086S超低溫冰箱(SANYO)；3K15型4 ℃高速臺式冷凍離心機(sigma)；Tissuelyser-24多樣品組織研磨機(上海凈信實業發展有限公司)；SpectraMax i3型全自動熒光酶標儀(Molecular)等。

2 方法

2.1 動物模型的建立及分組將實驗小鼠隨機分成平原對照組(Con組)、高原模型組(Hyp組)、紅景天苷組(Sal組)，每組16只。Con組和Hyp組的小鼠給予等量的滅菌注射用水，Sal組給予10 mg·kg-1的紅景天苷。

適應性喂養3 d后，各組小鼠按劑量預防灌胃給藥3 d后急進青海玉樹巴塘全軍高原環境損傷防治重點實驗室(海拔4 010 m)，運送途中果凍補水。抵達高原后，缺氧暴露1 d，期間繼續每日按劑量給藥，自由獲取食水，于末次給藥1 h后開始實驗。平原組的小鼠與高原組同時開始實驗。

2.2 Morris 水迷宮行為實驗Morris水迷宮由一個直徑120 cm的灰色圓形水池組成，水池壁標有4個明顯標記，并以此將水池分為4個象限，即第1、2、3和4象限。平臺位于第1象限中間位置，水深為高出平臺1 cm，水溫控制在(19～21) ℃，如Fig 1所示。實驗歷時6 d，前5 d學習記憶訓練，每天將小鼠面向池壁分別從不同象限的入水點放入水中，記錄其找到平臺所需的時間，即為潛伏期。如果在60 s內找不到平臺，則將其引導至平臺并停留10 s，潛伏期記為60 s，每日進行兩次測試，計算每個訓練日的平均值。d 6為正式實驗，記錄小鼠在沒有平臺的情況下游泳60 s內的潛伏期及穿越平臺次數。

Fig 1 Schematic diagram of Morris water maze experiment

2.3 小鼠腦組織氧化應激指標的測定按照試劑盒說明書檢測小鼠腦組織MDA含量、H2O2含量、GSH含量和SOD活力。

2.4 小鼠腦組織及血清神經遞質的測定通過摘眼球采血留取小鼠血液標本0.5 mL，室溫下靜置2 h后4 500 r·min-1離心10 min獲取血清。小鼠頸椎脫臼處死，獲取腦組織。按照試劑盒說明書檢測小鼠腦組織及血清中的谷氨酸含量及AChE活力。

2.5 小鼠腦組織HE染色及尼氏染色用多聚甲醛固定液固定小鼠腦組織，組織固定好后切片，脫蠟至水，進行蘇木精-伊紅染色或尼氏染色、脫水封片。

2.6 蛋白印跡法取小鼠海馬體組織加入預冷的RIPA裂解液(含1% PMSF)，置于冰上進行勻漿，充分研磨后繼續置于冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取上清液。用10% SDS-PAGE凝膠在恒壓條件下電泳后轉至PVDF膜上，在室溫下與5%脫脂牛奶孵育2 h。在4 ℃下條帶與一抗孵育過夜(Bax 1 ∶1 000；caspase-3 1 ∶500；Grin1 1 ∶1 000；β-actin 1 ∶3 000)。1× TBST洗滌3次，每次10 min，并在室溫下孵育二抗1 h。1× TBST洗3次，每次10 min，顯影。

2.7 統計學處理使用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。結果以均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

3 結果

3.1 紅景天苷對小鼠學習記憶的影響Morris水迷宮實驗是一項廣泛用于研究學習記憶的方法，本文首先通過測試小鼠潛伏期及穿越平臺次數研究小鼠學習記憶情況。結果如Fig 2所示，與Con組相比，Hyp組小鼠潛伏期從d 3開始明顯增加，穿越平臺次數明顯下降；與Hyp組相比，Sal苷組小鼠潛伏期在d 3開始明顯降低，穿越平臺次數明顯增加(均P<0.05)，說明紅景天苷可以改善高原低氧條件下小鼠的學習記憶能力。

3.2 紅景天苷對小鼠腦組織氧化應激指標的影響高原低氧環境造成的氧化應激會對小鼠腦組織神經元造成損傷，研究結果顯示，與Con組比較，Hyp組小鼠腦組織MDA和H2O2含量明顯升高，GSH含量明顯降低。與Hyp組比較，紅景天苷能降低小鼠腦組織中MDA和H2O2含量，提高GSH含量及SOD活力，表明紅景天苷可以減輕氧化應激損傷(P<0.01)，見Tab 1。

Fig 2 The protective effect of salidroside on memory deficits in mice induced by high altitude hypoxia(n=16)

Tab 1 Effects of salidroside on oxidative stress indicators in

3.3 紅景天苷對小鼠腦組織及血清神經遞質的影響乙酰膽堿(ACh)及谷氨酸在學習記憶過程中起重要的作用，而AChE活力會直接影響乙酰膽堿的含量。本部分主要通過測定組織及血清中AChE活力及谷氨酸含量等方面來進一步評價紅景天苷對低氧記憶損傷的改善作用。如Tab 2所示，與Con組比較，Hyp組小鼠腦組織和血清中乙酰膽堿酯酶活力明顯升高，給予紅景天苷后明顯下降(P<0.05或P<0.01)。在Hyp組中谷氨酸含量及谷氨酸受體(Grin1)表達明顯增高，紅景天苷預防給藥可明顯降低其含量及受體的表達(P<0.05或P<0.01)，如Fig 3所示，表明紅景天苷可以通過調節神經遞質水平改善小鼠的記憶能力。

Tab 2 Effects of salidroside on neurotransmitters in

Fig 3 Effect of salidroside on expression of Grin1 in mouse hippocampus

3.4 紅景天苷對小鼠腦組織病理變化的影響海馬體是大腦中學習記憶的重要區域，尼氏小體分布于神經細胞內，當尼氏小體染色變淡甚至溶解消失時，表明神經細胞受到損傷情況。在高原低氧條件下，小鼠腦組織神經元的結構完整性會受到影響，通過HE染色觀察海馬神經元結構完整性，尼氏染色進一步反映神經元功能活性。由Fig 4可以看出,Con組小鼠的海馬體神經元排列整齊，結構完整，核結構清晰，未出現明顯病理變化(Fig 4A-a)，海馬體尼氏小體含量豐富(Fig 4B-a)；Hyp組小鼠的海馬體神經元結構受到損害，核固縮明顯(Fig 4A-b)，尼氏小體數量減少(Fig 4B-b)；預防給予紅景天苷可以緩解這些損傷(Fig 4A-c)，增加尼氏小體數量(Fig 4B-c)，表明紅景天苷可以緩解高原低氧對小鼠腦組織神經元的損傷。

Fig 4 The pathological changes in mouse brain tissues

3.5 紅景天苷對小鼠海馬神經元Bax和caspase-3表達的影響學習記憶功能障礙是由神經元受損或凋亡引起，而凋亡過程主要與Bcl-2和caspase家族相關。如Fig 5所示，與Con組比較，Hyp組小鼠海馬中Bax和caspase-3含量明顯升高，給予紅景天苷后明顯下降(P<0.05或P<0.01)，結果表明中，在高原低氧條件下紅景天苷可以抑制小鼠腦組織神經元的凋亡。

Fig 5 Effects of salidroside on expression of Bax and caspase3 in mouse hippocampus

4 討論

高原低氧會導致組織氧氣供應失衡，缺氧會嚴重損害人類的認知和學習[8]。Morris水迷宮實驗是一項公認通過動物行為學來研究學習記憶的方法，可以減少氣味痕跡的干擾，被廣泛用于空間學習和記憶的神經生物學和神經藥理學研究。Xu等[9]用小鼠在Morris水迷宮中潛伏期及穿越平臺次數等指標研究藥物對認知功能的改善作用。本研究在高原低氧下進行Morris水迷宮測試，結果顯示，與Hyp組相比，Sal組潛伏期明顯減少，穿越平臺次數明顯增加，這些數據表明小鼠花費了更少的時間來尋找平臺，并且在平臺處多次探索，說明在高原低氧下紅景天苷提高了小鼠的記憶能力。

低氧誘導的氧化應激是許多神經退行性疾病的病因。低氧環境下相關ROS生成和抗氧化保護之間的不平衡會導致生物分子的氧化損傷，其中包括H2O2等自由基。ROS會誘導脂質氧化產生MDA，造成腦組織神經細胞的損傷和凋亡，導致學習與記憶功能障礙[10]。SOD和GSH作為抗氧化劑系統可以消除體內ROS，對機體起到保護作用[11]。研究結果顯示，紅景天苷可以減少高原低氧條件下小鼠腦組織中MDA、H2O2含量，提高GSH含量及SOD活力，表明紅景天苷可以通過減輕氧化應激損傷改善小鼠記憶能力。

乙酰膽堿和谷氨酸與神經元信息傳遞、營養發育和學習記憶等過程有著緊密的聯系。神經遞質的水平會影響神經元的功能，包括神經遞質的含量及參與神經遞質釋放過程的分子和靶標。乙酰膽堿是與學習、記憶密切相關的重要中樞膽堿能神經遞質，海馬中ACh水平的降低能夠引起學習記憶障礙[12]，含量水平與AChE活性相關。正常生理狀態下，AChE能夠維持ACh含量的穩定，避免其對于突觸后膜受體的過度刺激；病理條件下，AChE活性的異常升高，使ACh降解速度加快，從而造成含量顯著降低，生物信號不能得到正常傳導。另外，谷氨酸是人體內重要的神經遞質，參與維系腦部的血液循環，調控人腦的功能；其在人體內屬低水平游離氨基酸，含量過高(細胞毒性)引起認知功能障礙[13]。在本研究中，紅景天苷可以降低小鼠腦組織和血清中的乙酰膽堿酯酶活力及谷氨酸含量，同時降低Grin1的表達，表明紅景天苷可能通過調節神經遞質水平改善小鼠記憶能力。

海馬體是大腦中學習和記憶的重要區域，因此海馬神經元的結構和功能備受關注[14]。有研究表明，急性高原缺氧下大鼠海馬體嚴重受損，錐體細胞數量減少，色酸性凝結和神經變性[15-16]。病理實驗結果表明，高原低氧條件下小鼠海馬體的神經元紊亂變性甚至凋亡，給予紅景天苷可以緩解神經元的損傷。缺氧環境會增加海馬體中caspase-3表達的增加并誘導海馬神經元的凋亡[17-18]。本研究結果顯示，紅景天苷可以減少促凋亡因子Bax及caspase-3的表達，表明紅景天苷可以抑制神經元凋亡，保護海馬神經元免受急性高原缺氧損傷。

綜上所述，高原低氧條件下紅景天苷可以通過減少氧化應激損傷/調節神經遞質水平以及抑制神經元凋亡來減輕急性缺氧誘導的記憶障礙。因此，本研究為將紅景天苷作為改善急性高原低氧下認知障礙的潛在治療藥物提供了理論基礎。