愛帕琳肽13/血管緊張素受體AT1相關受體蛋白同源二聚體對人臍靜脈內皮細胞行為的影響

王德秀，李建設，宋 超，王太千，殷 月，肖長昊，王學健，魯 洪，蔡 欣

(濰坊醫學院1.基礎醫學院、2.臨床醫學院、3.生命科學與技術學院、4.藥學院，山東 濰坊 261053)

近年來，隨著生活水平的不斷提高，動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、心衰等心血管疾病的發病率越來越高，嚴重威脅著人類的健康，探究這類疾病發病的病理生理機制以及尋找有效的藥物成為當今的一項重大任務。血管重構(vascular remodeling，VR)是動脈血管內皮受損后，為適應內外環境變化而發生的結構和功能的改變，包括血管壁細胞的增生、肥大、凋亡、遷移、細胞外基質的產生及降解等細胞生物學變化[1]。研究發現VR既是心血管疾病惡化的重要病理基礎，也是心血管疾病發生和發展的病因，因此，探究VR過程中血管內皮細胞的行為學已成為治療心血管疾病的關鍵環節。

血管緊張素受體AT1相關受體蛋白(putative receptor protein related to AT1，APJ)是G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)A類家族的成員之一，在心血管系統具有較高表達水平，愛帕琳肽(Apelin)是APJ的內源性配體，Apelin/APJ系統能促進細胞的增殖、遷移，還可促進血管生成，參與心血管功能，在心血管調節中具有降低血壓、增強心臟收縮的作用，是心血管穩態中重要的調節因子[2]。近幾年，APJ作為心血管相關疾病治療靶點的潛力引起了越來越多的關注。事實上，臨床前和最近的臨床證據都表明，APJ是治療肺動脈高壓、動脈粥樣硬化、心衰等心血管疾病的重要靶點[3-4]。本課題組前期研究發現，APJ除了能以單體的形式存在，還可以形成同源二聚體，在受體密度小于0.3顆粒/平方微米(particles/μm2)的情況下(靜息狀態)，APJ同源二聚體占APJ總量的36%，Apelin-13能上調APJ表達，且同源二聚體的表達也隨之升高[5]，另外，APJ同源二聚體具有不同于單體的信號通路，能激活Gαi3和Gαq信號通路[6]。因此，本課題探討APJ同源二聚體對人臍靜脈內皮細胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)增殖、遷移和管腔形成能力的影響，該研究將有助于為臨床的血管修復重建以及心血管疾病的治療提供新靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞HUVECs和中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell, CHO)(中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)。

1.2 藥品與試劑Apelin -13(美國Phoenix Pharmaceuticals Inc，批號：427374)，DMEM基礎培養基(美國Cytiva公司，批號：SH30243.01)，胰酶EDTA消化液和青鏈霉素溶液(100×)(北京索萊寶公司，批號：T1300、P1400)，Biocoat 356234 Matrigel基質膠(美國康寧公司，批號：356234)，兔抗APJ抗體和小鼠抗β- actin抗體(美國Proteintech公司，批號：20341-1-AP、66009-1-Ig)，Laser BioLab MALDI Calibration kit和MonoTip C18(日本Shimadzu公司，批號：TO-724R00、5010-21002 )。

1.3 儀器Herocell 180型細胞培養箱(美國Thermo公司)，multiskan go酶標儀和FluorChem Q化學發光凝膠成像系統 (美國Protein Simple公司)，AXIMA Assurance基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀(日本Shimadzu公司)，xCELLigence實時細胞分析儀(美國ACEA Biosciences公司)

1.4 方法

1.4.1細胞培養 HUVECs和CHO細胞置于10% FBS的DMEM培養基，于37 ℃，5% CO2的培養箱進行常規培養。

1.4.2Western blot實驗 棄掉培養基，預冷PBS洗滌細胞，加入含有PMSF的RIPA裂解液，槍頭吹打，收集細胞到EP管中，4 ℃離心，取上清，一部分樣品用于BCA法測定蛋白濃度，剩余樣品加入4×上樣緩沖液，煮沸10 min，分裝進行Western blot。樣品經電泳和轉膜后，用脫脂奶粉封閉1 h，兔抗APJ(1 ∶1 000)于4 ℃冰箱內孵育過夜后，洗膜，HRP 標記的山羊抗兔多克隆抗體( 1 ∶2 000)于室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL化學發光工作液，采用超靈敏化學發光成像儀成像，隨后用超純水和再生液處理膜，進行內參β-actin的表達，抗體分別是鼠抗β-actin(1 ∶1 000)和山羊抗鼠單克隆抗體( 1 ∶10 000)。根據得到的條帶對實驗結果進行定量分析。

1.4.3基質輔助激光解吸飛行時間質譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Fligh Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)分析 HUVECs長到90%左右將蛋白提出，分別加入5 μL兔抗APJ抗體和50 μL protein A/G beads 4 ℃孵育過夜，3 000×g離心去除上清，TBS 溶液清洗3次，0.1 mol·L-1glycine-HCl 洗脫抗原后，3 000×g離心，取上清為待分析蛋白樣品。所得待分析蛋白樣品經 MonoTip C18脫鹽后上樣。樣品檢測結果用 Laser BioLab MALDI Calibration kit 進行校正。

1.4.4Apelin-13引起50%最大效應的濃度 (EC50)的檢測 在E-Plate16的孔中加入100 μL培養基后，進行基線檢測(cell index<0.063)，隨后向孔中再加入100 μL HUVECs懸液，10 000個細胞/孔，在培養箱中放置 30 min 后，放在實時細胞分析儀(Real-Time Cell Analyzers，RTCA)上，24 h后，分別用0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5和 10 μmol·L-1的 Apelin-13 處理HUVECs，結果用 RTCA Software 2.0進行分析。

1.4.5細胞分組 課題組前期研究發現，APJ同源二聚體在Apelin-13的刺激下表達增多，且APJ 的跨膜區1(transmembrane domain 1，TM1)能阻斷APJ同源二聚體的形成[5]，基于此，本研究通過添加Apelin-13作為APJ同源二聚體組，添加 TM1作為APJ單體組。將HUVECs分為空白對照組、APJ同源二聚體組和APJ單體組，分別用 PBS、Apelin-13(100 nmol·L-1)+PBS和Apelin-13(100 nmol·L-1)+TM1(4 μmol·L-1)處理，APJ單體組中TM1在37 ℃，孵育1 h后再加入Apelin-13。

1.4.6CCK-8實驗 HUVECs消化后按1×105個/孔接種于96孔板中。待細胞長至貼壁后，加入10 μL/孔的CCK-8溶液，根據分組條件對各組細胞進行不同刺激，37 ℃，1 h，用酶標儀(450 nm)測定各孔的吸光度(OD) 。

1.4.7細胞劃痕實驗 細胞培養于6孔板，待長到80%左右，去除培養基，用10 μL槍頭在孔中間劃一道豎線，PBS洗兩遍去除劃下來的細胞，然后根據分組條件對各組細胞進行不同刺激，并放入培養箱內繼續培養，分別于2、4、8、16和24 h后拍照觀察細胞遷移的狀態，進行統計學分析。

1.4.8細胞成管實驗 實驗前24 h將高壓好的100 μL槍頭放入 -20 ℃冰箱預冷，基質膠放入4 ℃ 冰箱液化備用。用預冷槍頭向置于冰上的96孔板中加入80 μL/孔的基質膠，隨后放入培養箱中固化基質膠1 h。各組細胞用胰酶進行消化，按照2×104個細胞/孔的密度種在基質膠上，并將96孔板放于37 ℃、5 % CO2培養箱中繼續孵育4 h后，顯微鏡下觀察HUVECs的成管情況并拍照計算形成管腔數，做統計學分析。

2 結果

2.1 APJ在HUVECs中的表達將HUVECs和CHO細胞提取蛋白后進行Western blot實驗，根據APJ 的蛋白分子量發現(Fig 1)，HUVECs中蛋白在43 kD處存在表達，與理論值相符，CHO無表達，表明HUVECs中存在APJ的表達。

Fig 1 Expression of APJ in HUVECs and CHO

2.2 APJ同源二聚體在HUVECs中的表達根據MALDI-TOF MS質譜掃描結果進行數據分析，如Fig 2所示，APJ不僅能以單體的形式存在，還能以同源二聚體形式在HUVECs中表達，且同源二聚體表達量是單體的0.22倍(P<0.01)。

Fig 2 Expression of APJ homodimer in

2.3 不同濃度的 Apelin-13 對HUVECs活力的影響為了探究APJ同源二聚體對HUVECs行為的影響，我們首先用RTCA檢測引起 50%最大效應的濃度(EC50)，如Fig 3A所示，分別用不同濃度的Apelin-13(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5和10 μmol·L-1)處理HUVECs ，并用 RTCA Software 2.0 對結果進行分析，如Fig 3B所示，EC50為 2.26×10-8mol·L-1，且引起最大效應的濃度為1×10-6mol·L-1。

Fig 3 Effects of different concentrations of Apelin-13

2.4 APJ同源二聚體促進HUVECs增殖本實驗利用CCK-8法檢測對照組、APJ同源二聚體組和單體組的HUVECs增殖情況，如Fig 4所示，與PBS組相比，Apelin-13+PBS和Apelin-13+TM1組的HUVECs的增殖顯著增加，16 h的增殖最快，同時，Apelin-13+PBS組HUVECs的增殖效果明顯快于Apelin-13+TM1組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明APJ同源二聚體的促增殖能力強于APJ單體。

Fig 4 Effect of APJ homodimer on proliferation

2.5 APJ同源二聚體促進HUVECs遷移HUVECs劃痕實驗結果如Fig 5A所示，隨著培養時間的不斷延長，各組細胞向劃痕裸區遷移，劃痕距離逐漸減小。數據統計如Fig 5B所示，與PBS組相比，各時間點的Apelin-13+PBS組和Apelin-13+TM1組的遷移速度明顯加快，其中Apelin-13+PBS組的遷移速度明顯快于Apelin-13+TM1組，且16 h的遷移速度最快(P<0.01)，表明APJ同源二聚體的促遷移能力高于APJ單體。

Fig 5 Effect of APJ homodimer on migration

2.6 APJ同源二聚體促進HUVECs成管鏡下觀察 HUVECs 成管情況，如Fig 6A所示，發現各組細胞在基質膠上培養4 h后均出現成管，激動劑處理時間越長，小管的密度越多，總管腔面積也越大。數據統計如Fig 6B所示，與PBS組相比，各時間點的Apelin-13+PBS組和Apelin-13+TM1組的細胞成管數目明顯增多，16 h細胞成管數目最多，且Apelin-13+PBS組的成管數目明顯多于Apelin-13+TM1組(P<0.05)，表明APJ同源二聚體的促成管能力高于APJ單體。

Fig 6 Effect of APJ homodimer on tube formation

3 討論

生理狀態下，成體的血管內皮細胞更新率很低，但是在病理狀態(如動脈粥樣硬化、惡性腫瘤、糖尿病等)下可以發生血管新生，即血管內皮細胞脫離原來的靜息狀態，出現增殖、遷移并以出芽方式形成管狀結構，管狀結構的不斷延伸逐漸與周圍血管連接形成新生血管[7-8]。血管新生在腫瘤生長、血管生成、血管重構和炎癥反應等許多生理病理過程中發揮著關鍵作用[9-10]。在視網膜血管系統中，內皮細胞遷移引起血管收縮，收縮的血管通過內皮細胞遷移的方式進行血管重塑，形成完整的血管網絡；高糖誘導細胞焦亡分泌的白介素1β通過促進大鼠原代主動脈平滑肌細胞增殖遷移，加速動脈損傷后內膜的新生[11]。人參皂苷通過促進血管生成改善糖尿病大鼠的皮膚損傷[12]，卵泡抑素樣蛋白1通過增強肺動脈內皮細胞的增殖、黏附以及血管的形成進行肺血管重塑，從而預防和治療肺動脈高壓[13]。可見，內皮細胞正常的增殖、遷移和成管在VR和各類心血管疾病中發揮著非常重要的作用。

Apelin是第一個被發現的APJ的內源性配體，在心血管系統中發揮著重要作用，大量研究表明， Apelin/APJ系統能通過ERK/cyclinD1途徑促進血管平滑肌細胞的增殖[14]，在自發性高血壓大鼠中通過激活自噬促進血管平滑肌細胞增殖[15]。Apelin/APJ系統還可促進H9c2心肌細胞和人主動脈血管平滑肌細胞的增殖[16-17]。另外，Apelin-13能夠促進猴脈絡膜/視網膜內皮細胞增殖、遷移和管腔的形成，加速視網膜新生血管的形成。本課題組前期通過生物物理和生物化學的方法(免疫共沉淀、熒光共振能量轉移與生物發光共振能量轉移等)已在體外檢測到APJ同源二聚體的存在[5]，本實驗通過Western blot和MALDI-TOF MS在原生細胞中再次證實，APJ和APJ同源二聚體均能表達于HUVECs，且Apelin-13的EC50為 2.26×10-8mol·L-1，引起最大效應的濃度為1.0×10-6mol·L-1。隨后我們利用CCK-8實驗測定在1.0×10-7mol·L-1Apelin-13的刺激下，APJ同源二聚體對HUVECs增殖的影響，實驗結果發現，Apelin-13+PBS組(APJ同源二聚體組)和Apelin-13+TM1組(APJ單體組)的HUVECs的增殖能力較PBS組顯著增強，且Apelin-13+PBS組的增殖效果明顯好于Apelin-13+TM1組，同時，發現Apelin-13處理16 h的增殖最快，說明APJ同源二聚體的促增殖能力強于APJ單體。利用細胞劃痕法檢測APJ同源二聚體對HUVECs遷移的影響，結果顯示Apelin-13+PBS組細胞向劃痕裸區遷移速度明顯快于Apelin-13+TM1組，且16 h的遷移速度最快，表明APJ同源二聚體的促遷移能力高于APJ單體。通過人工基底膜(Matrigel)包被檢測APJ同源二聚體對HUVECs成管能力的影響，結果發現細胞在基質膠中孵育后均能出現成管，隨著激動劑刺激時間延長，小管的密度逐漸增多，總管腔面積也逐漸增大。各時間點的Apelin-13+PBS組和Apelin-13+TM1組的細胞成管數目明顯多于PBS組，激動劑刺激16 h細胞成管數目最多，且Apelin-13+PBS組的成管數目明顯多于Apelin-13+TM1組，上述結果表明APJ同源二聚體的促增殖、遷移和成管能力均高于APJ單體。

綜上，本實驗研究發現，APJ同源二聚體對HUVECs增殖、遷移和血管形成都有促進作用，優于單體，且激動劑處理16 h后的作用最為顯著。我們將以此為基礎，進一步探究APJ同源二聚體對VR的調節機制，為 APJ 參與的重要生理病理過程(動脈粥樣硬化、高血壓等)提供細胞內分子機制的實驗依據，有助于更精確地了解相關疾病的發生并提供更有效的、特異的治療靶點。