薄荷醇通過調節角質形成細胞內鈣離子濃度而產生促透作用

劉文彬, 黃 釗, 王 暉

(1. 廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院, 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室, 2. 廣東藥科大學中藥學院, 廣東 廣州 510006)

藥物經皮吸收進入血液循環是一種給藥途徑，但是皮膚屏障在保護機體免受外界損傷的同時，也限制了藥物經皮吸收的速率，應用皮膚吸收促進劑(PE)是增加藥物經皮吸收的一種常用方法[1]。薄荷醇是一種單萜類物質，作為PE已得到廣泛應用。目前針對薄荷醇促透機制的研究尚存在爭議，如 Yang等[2]研究認為，薄荷醇在低濃度下破壞角質層有序的脂質結構，高濃度改善藥物在角質層中的分配發揮促透作用；Huang等[3]研究發現，薄荷醇可直接改變脂質的厚度和流動性，促進槲皮素的跨膜轉運；Chen等[4]研究認為，薄荷醇發揮促透作用主要從兩個方面，一是競爭脂質-脂質氫鍵位點，從而降低脂質穩定性，二是薄荷醇具有很強的膽固醇親和力，可增加類脂膜的流動性。在本課題組的前期研究中通過光鏡、掃描電鏡、透射電鏡觀察發現，應用薄荷醇后可導致皮膚角質層細胞間隙增大和細胞排列發生改變[5-6]，但是，薄荷醇如何引起上述變化而發揮促透作用的分子機制尚不清楚。因此，本研究在體外建立角質形成細胞單層模型，考察薄荷醇的體外促透作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體FITC-BSA購自于北京索萊寶科技有限公司(貨號：SF063)；Keratinocyte-SFM培養基購自于美國Gibco公司(貨號：1134210)；U73122購自于美國Sigma公司(批號：U6756)；硝苯地平購自于美國Sigma公司(批號：040M19120)；白屈菜紅堿購自于上海晶純試劑有限公司(批號：C107686)；薄荷醇購自于上海晶純試劑有限公司(批號：110716)；考馬斯亮藍(R250)購自于北京鼎國生物技術有限責任公司(批號：69P10150)；ATP含量檢測盒購自于南京建成生物工程所(批號：20120321)；超微量Ca2+-ATP酶試劑盒購自于南京建成生物工程所(批號：20121009)；Fluo-3/AM熒光探針購自于碧云天生物技術研究所(批號：S1056)；PLC ELISA試劑盒購自于上海百沃科貿有限公司(批號：BV-E121022)；PKC ELISA試劑盒購自于上海百沃科貿有限公司(批號：BV-E110905)。

1.2 KC的原代培養包皮組織移入0.25% DispaseⅡ分離表皮和真皮，表皮剪成碎片，37 ℃下使用胰蛋白酶水解消化5～7 min，離心5 min收集細胞。使用KC-SFM培養基，在5% CO2、37 ℃、90%濕度條件繼續培養至融合度達到80%～90%，0.25%胰酶消化傳代。

1.3 薄荷醇對KC單層細胞模型連接緊密性的影響胰蛋白酶消化重懸細胞，調整細胞數量為1×104/孔,接種至12孔Transwell(孔徑0.4 μm)小室內，培養至細胞完全融合。用含有不同藥液的培養基培養細胞2 h后，檢測細胞電阻抗(TEER)，每組設3個復孔。1×104KC細胞接種至Transwell小室內至融合后，內室換為含0.05 g·L-1FITC-BSA的培養基，外室中加入含有不同藥液的培養基培養細胞6 h后，收集內室液體。激發波長520 nm，發射波長492 nm，熒光分光光度計測定內室液體吸光度值[7]。

1.4 薄荷醇對KC細胞內Ca2+濃度的影響KC細胞分為不同組別，添加不同組別的培養基繼續培養5 min，離心沉淀細胞，吸去培養基。將細胞重懸于終濃度為2 μmol·L-1Fluo-3/AM溶液，37 ℃避光孵育30 min。激發波長488 nm，發射波長525 nm，流式細胞儀測量細胞的熒光強度。

1.5 薄荷醇對KC細胞內Ca2+-ATP酶活性、PLC活性、PKC活性和ATP含量的影響將KC根據實驗分組，加入相應的培養基后培養4 h。細胞消化，離心，收集細胞，勻漿器破碎細胞制備細胞懸液，采用試劑盒檢測Ca2+-ATP酶活性、PLC活性、PKC活性。同法細胞培養4 h后，收集細胞，90 ℃～100 ℃水浴勻漿破碎，沸水浴中加熱10 min，采用試劑盒檢測ATP含量。

1.6 薄荷醇對KC微絲骨架結構的影響接種KC于預置玻片的6孔板中，細胞貼壁后48 h，加入相應的培養基后培養細胞4 h。參考文獻方法[8]，對培養的細胞依次進行2.5%戊二醛固定、考馬斯亮藍染色，玻片置于甲醇冰醋酸溶液中脫色。倒置顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果

2.1 薄荷醇對KC單層細胞模型連接緊密性的影響分別采用0、50、100和200 μmol·L-1薄荷醇處理KC單層細胞模型，測定TEER和FITC-BSA滲透量。結果顯示，薄荷醇能劑量依賴性降低TEER和增加FITC-BSA滲透量(P<0.05)，表明薄荷醇能降低KC細胞間的連接緊密性。相對于200 μmol·L-1薄荷醇組，10 μmol·L-1U73122+200 μmol·L-1薄荷醇組和100 μmol·L-1硝苯地平+200 μmol·L-1薄荷醇組TEER明顯升高(P<0.05)，FITC-BSA滲透量明顯降低(P<0.05)，表明PLC抑制劑U73122和鈣通道阻滯劑硝苯地平可以逆轉薄荷醇引起的KC連接緊密度下降，見Fig 1。

Fig 1 Effect of menthol on junction tightness of KC monolayer cell model

2.2 薄荷醇對KC細胞內Ca2+濃度的影響流式細胞儀結果顯示，薄荷醇能劑量依賴性增加KC細胞內Ca2+濃度(P<0.05)。10 μmol·L-1U73122+200 μmol·L-1薄荷醇組和100 μmol·L-1硝苯地平+200 μmol·L-1薄荷醇組胞內Ca2+濃度明顯低于200 μmol·L-1薄荷醇組(P<0.05)，表明PLC抑制劑U73122和鈣通道阻滯劑硝苯地平可以降低薄荷醇引起的KC細胞內Ca2+濃度升高，見Fig 2。

Fig 2 Effect of menthol on intracellular Ca2+ concentration of KC

2.3 薄荷醇對KC細胞內Ca2+-ATP酶、ATP的影響薄荷醇能劑量依賴性降低KC細胞內Ca2+-ATP酶活性和ATP含量(P<0.05)。10 μmol·L-1U73122+200 μmol·L-1薄荷醇組胞內Ca2+-ATP酶活性和ATP含量高于200 μmol·L-1薄荷醇組(P<0.05)，表明PLC抑制劑U73122可以降低薄荷醇引起的KC細胞內Ca2+濃度升高，見Fig 3。

Fig 3 Effects of menthol on Ca2+- ATPase and

2.4 薄荷醇對KC細胞PLC活性的影響薄荷醇能劑量依賴性增加KC細胞內PLC活性(P<0.05)。10 μmol·L-1U73122+200 μmol·L-1薄荷醇組胞內PLC活性低于200 μmol·L-1薄荷醇組(P<0.05)，表明PLC抑制劑U73122可以降低薄荷醇引起的PLC活性升高，見Fig 4。

Fig 4 Effects of menthol on PLC in KC

2.5 薄荷醇對KC細胞PKC活性的影響薄荷醇能劑量依賴性增加KC細胞內PKC活性(P<0.05)。10 μmol·L-1U73122+200 μmol·L-1薄荷醇組和5 μmol·L-1白屈菜紅堿+200 μmol·L-1薄荷醇PKC活性低于200 μmol·L-1薄荷醇組(P<0.05)，表明PLC抑制劑U73122和PKC抑制劑白屈菜紅堿可以降低薄荷醇引起的PLC、PKC活性升高，見Fig 5。

Fig 5 Effects of menthol on PKC in KC

2.6 薄荷醇對KC微絲骨架結構的影響考馬斯亮藍染色結果顯示，角質形成細胞呈不規則鵝卵石形狀，細胞間連接緊密(Fig 6A)。薄荷醇處理以后，角質形成細胞顯著收縮，細胞間可見明顯的間隙(Fig 6B)。不同濃度白屈菜紅堿處理后，可明顯逆轉薄荷醇引起的角質形成細胞間隙增大(Fig 6C和Fig 6D)。

Fig 6 Effects of menthol on microfilament skeleton structure in KC (1000×)

3 討論

既往的對PE促透機制研究多集中于促透劑對角質層中生化成分的結構、狀態及構象的影響，如改變角質層脂質排列的有序性和相變溫度[9]、加快角蛋白碳的運動、增加角質層的無序性而促進藥物的吸收等[10]，而忽略了PE對細胞與細胞之間連接的影響。表皮分為基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質層。角質層主要由KC細胞組成，相互連接的KC細胞構成了表皮的主要屏障。KC間連接的緊密程度直接影響表皮的滲透性及其功能[11]，而藥物經皮吸收的一個重要途徑就是細胞間隙擴散，細胞之間連接的緊密程度直接影響了藥物的經皮吸收量。因此本文以人原代角質形成細胞為研究對象建立了KC單層模型，考察薄荷醇對KC細胞模型的連接緊密性的影響。研究結果顯示，薄荷醇可明顯的降低細胞間的連接緊密程度，降低細胞間TEER，增加FITC-BSA的跨膜滲透量。

在正常的表皮中，由內到外從基底層到角質層Ca2+濃度逐漸升高。Ca2+濃度對于維持KC細胞的正常功能具有重要作用，如促進KC細胞的增殖、分化和皮膚修復等[12]。有研究報道，KC細胞內外的Ca2+濃度發生變化，可導致KC細胞間的間隙增大，從而增大皮膚對藥物的滲透性[13]。我們通過流式細胞術顯示，薄荷醇可以增加細胞內的Ca2+濃度。因此，我們推測薄荷醇的促透作用可能與薄荷醇增加細胞內的Ca2+濃度有關。

那薄荷醇是如何影響KC細胞內Ca2+濃度的呢？細胞內的Ca2+主要來源于兩個方面，一是由細胞膜上鈣離子通道從胞外直接流入胞內，二是通過內源性鈣池釋放[14]。內源性鈣池由PLC調控，細胞膜上的PLC被激活后可促進4,5-二磷酸磷脂酰胺肌醇(4,5-phosphate-dylinositidediphosphate, PIP2)水解形成三磷酸肌醇(inositol-1,4,5-tripho- sphate，IP3)和甘油二酯(duacykycerol，DAG)，IP3增加后可促進鈣池釋放Ca2+，從而使胞內Ca2+濃度升高[15]。PIP2水平下降可降低胞內Ca2+-ATP酶活性。DAG可促進ATP外流，降低胞內ATP濃度，ATP的減少同樣可降低Ca2+-ATP酶活性[16]。Ca2+-ATP酶(即Ca2+泵)使胞內Ca2+不能泵出到胞外，進一步間接增加胞內的Ca2+濃度[17]。我們對KC單層模型分別使用鈣離子通道阻滯劑硝苯地平和PLC阻滯劑U73122后，均可使胞內Ca2+濃度顯著下降，薄荷醇引起的細胞間的連接緊密程度下降也被逆轉。因此，薄荷醇可能通過增強PLC活性釋放胞內鈣池Ca2+，促進外源性Ca2+內流，共同增加胞內Ca2+濃度。

PKC是G蛋白偶聯受體系統中的效應物，其激活既依賴膜脂甘油二酯的出現，又依賴細胞質中Ca2+濃度的升高[18]。PKC激活后，可參與多種生化反應和基因表達的調控。在表皮PKC激活后可使細胞某些蛋白磷酸化，而影響細胞的骨架結構和細胞膜穩定性，從而使屏障作用減弱。本實驗證實薄荷醇可使KC細胞間的間隙增加，且該作用與PKC的活性有關。因此，我們推斷薄荷醇通過增加KC胞內Ca2+濃度，上調PKC活性，從而降低細胞間的連接緊密性發揮促透作用。

綜上，薄荷醇通過增加KC胞內Ca2+濃度發揮促透作用，其增加胞內Ca2+濃度作用與增強PLC活性，促進外源性Ca2+內流有關。