基于細(xì)胞信號通路探討黃芪活性成分抗肝纖維化的研究進(jìn)展

李淑娣，王 振，劉江凱，李香香，楊 星，段 飛，李素領(lǐng)

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃肝膽科，河南 鄭州 450000)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是存在于大多數(shù)慢性肝臟疾病過程中的病理變化，主要表現(xiàn)為肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度增生與沉積，其本質(zhì)是一種可逆的肝組織損傷過度修復(fù)反應(yīng)[1]。肝纖維化若未得到及時(shí)治療及控制，可進(jìn)展為肝硬化、肝癌或肝衰竭，逆轉(zhuǎn)肝纖維化是防止慢性肝病進(jìn)展的重要手段[2]。目前，尚未有公認(rèn)特異有效的治療肝纖維化的化學(xué)藥物和生物制劑[3]。近年來，中醫(yī)藥抗肝纖維化的研究成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)，多項(xiàng)研究顯示，中醫(yī)藥在抗肝纖維化的治療中起重要作用[4]。

黃芪，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物膜莢黃芪或蒙古黃芪的干燥根，內(nèi)含黃酮類化合物、皂苷類化合物、多糖類化合物和氨基酸類化合物等多種活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗纖維化、抗腫瘤、抗糖尿病、降壓等多種藥理活性[5]。近年來有大量研究表明，黃芪活性成分可通過減輕肝臟炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抑制肝星狀細(xì)胞活化、促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡、抑制肌成纖維細(xì)胞合成、減少細(xì)胞外基質(zhì)合成等方面發(fā)揮抗肝纖維化的作用[6-7]，但對其調(diào)控細(xì)胞信號通路的作用機(jī)制尚缺乏最新的綜述。本文通過梳理黃芪及其活性成分抗肝纖維化的關(guān)鍵信號通路，為進(jìn)一步闡明黃芪防治肝纖維化的分子機(jī)制提供理論支持，也為抗肝纖維化藥物的開發(fā)提供新思路和參考。

1 肝纖維化發(fā)生機(jī)制

肝臟受損后，大量的炎性細(xì)胞因子分泌，激活靜息狀態(tài)下的肝星狀細(xì)胞 ( hepatic stellate cell，HSC)，活化的HSC增殖，轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA) 的肌成纖維細(xì)胞，大量合成如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分(extracellular matrix，ECM)，致使 ECM 的合成與降解失衡，過量沉積在肝組織內(nèi)，最終導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)的破壞和肝纖維化的形成[8]。HSC是一種肝臟非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞，主要分布于Disse間隙內(nèi)，包繞在肝竇周圍，占非實(shí)質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的5%～10%，被認(rèn)為是肝纖維化細(xì)胞的主要來源，HSC的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，抑制HSC增殖、誘導(dǎo)其凋亡，從而減少ECM生成是治療肝纖維化的重點(diǎn)[1]，見Fig 1。

Fig 1 Mechanism of hepatic fibrosis

2 黃芪活性成分在HF中對p38MAPK信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制

2.1 p38MAPK信號通路在研究肝纖維化中的作用p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)是MAPK家族的重要成員，轉(zhuǎn)錄激活因子-2 (activating transcription factor 2，ATF-2)是p38MAPK通路的重要下游因子，p38MAPK可活化AFT-2，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞生長、分化、免疫應(yīng)答、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡的基因轉(zhuǎn)錄，影響肝纖維化的進(jìn)程[9]。研究發(fā)現(xiàn)[10]，p38MAPK可在肝纖維化進(jìn)程中調(diào)節(jié)HSC的活化，HSC活化程度越高，p38MAPK磷酸化程度越高，而阻斷p38MAPK信號通路后HSC活化度降低。已有研究證實(shí)，p38MAPK阻斷劑SB203580在阻斷P38MAPK通路后，可以降低靜息HSC的蛋白表達(dá)，并可調(diào)節(jié)其細(xì)胞周期，影響肝纖維化的進(jìn)程[11]。以上研究表明，p38MAPK信號通路可能通過促進(jìn)HSC激活而影響HF進(jìn)程，提示抑制p38MAPK信號通路可能是HF治療的方向。

2.2 黃芪活性成分在HF中調(diào)節(jié)p38MAPK信號通路的機(jī)制MAPK激酶-3(MAPK kinase 3，MKK3)是一組具有雙重磷酸化能力的蛋白激酶，是p38MAPK上游激活物，p38MAPK被磷酸化激活后誘發(fā)特定基因的表達(dá)，在肝纖維化中有重要作用。雷玲等[12]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能明顯降低肝纖維化大鼠肝臟中MKK3的表達(dá)、磷酸化p38MAPK及其下游轉(zhuǎn)錄因子AFT-2的表達(dá)，調(diào)控p38MAPK信號傳導(dǎo)通路上下游相關(guān)蛋白，抑制致纖維化因子的表達(dá)，抑制肝纖維化的形成。氧化應(yīng)激是HSC活化、肝纖維化發(fā)生的重要影響因素，谷胱甘肽(glutathione，GSH)是豐富的抗氧化分子，在纖維化疾病中濃度降低。作為黃芪中活性較高的皂苷類成分，黃芪甲苷具有缺血性保護(hù)、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化等作用[6]。LI等[13]研究表明，黃芪甲苷通過誘導(dǎo)Nrf2的表達(dá)增加GSH含量，而抑制氧化應(yīng)激，并參與p38MAPK磷酸化抑制，從而抑制HSC激活。林紅等[14]發(fā)現(xiàn)，黃芪后處理可通過內(nèi)源性機(jī)制激發(fā)p38MAPK信號表達(dá)，競爭性抑制Smad2/3向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，阻斷TGF-β1信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，使I和III型膠原的表達(dá)減少，而發(fā)揮抗纖維化的作用。以上提示黃芪有效成分可通過調(diào)節(jié)p38MAPK信號通路抑制氧化應(yīng)激、抑制膠原合成、抑制HSC活化而發(fā)揮抗肝纖維化作用，見Tab 1。

Tab 1 The main mechanism of Astragalus active ingredient regulating p38MAPK pathway

3 黃芪活性成分在HF中對TGF-β1/Smads信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制

3.1 TGF-β1/Smads信號通路在研究HF中的作用TGF-β1主要來源于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和HSC，作為目前最強(qiáng)的促纖維化細(xì)胞因子之一，其幾乎在肝纖維化的所有關(guān)鍵環(huán)節(jié)都有參與。在TGF-β1信號從細(xì)胞膜受體上傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)的過程中，Smads蛋白是關(guān)鍵蛋白，當(dāng)TGF-β1被活化后會誘導(dǎo)下游Smad2、3蛋白磷酸化，與Smad4蛋白結(jié)合形成的Smad復(fù)合物與纖維化有關(guān)的靶基因結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，影響HSC活化而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[15]。TGF-β1/Smads信號通路在HSC的活化與增殖、ECM的沉積及肝纖維化發(fā)生發(fā)展的過程中具有至關(guān)重要作用，是TGF-β1促纖維化作用中最經(jīng)典的途徑[16]。以上研究提示，TGF-β1/Smads信號通路與HF發(fā)生發(fā)展過程中多方面密切相關(guān)。

3.2 黃芪活性成分在HF中調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路的機(jī)制黃芪多糖是黃芪中主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗動脈粥樣硬化、抗纖維化等多種生物功能。黃進(jìn)等[17]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可對TGF-β1/Smads信號通路的傳導(dǎo)多點(diǎn)調(diào)節(jié)，降低肝組織中的TGF-β1的表達(dá)，下調(diào)Smad3/4表達(dá)，保護(hù)正常肝組織的基底膜樣細(xì)胞間質(zhì)，修復(fù)受損肝纖維化組織，減輕肝纖維化程度。徐方明等[18]在繼發(fā)性膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可使肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯降低，使肝組織中羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量明顯降低，纖維組織的增生程度明顯減輕，進(jìn)而發(fā)揮抗繼發(fā)性膽汁淤積性肝纖維化作用。毛蕊異黃酮是黃芪中的異黃酮類活性成分，具有明顯的抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。任爽等[19]研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮能夠抑制HSC活化，是通過抑制TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少TGF-β1、Smad2的表達(dá)，增加Smad7表達(dá)這一途徑而實(shí)現(xiàn)的。以上提示黃芪有效成分可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路在HF的炎癥反應(yīng)、HSC活化、肌成纖維細(xì)胞合成、ECM沉積等過程中發(fā)揮重要作用，見Tab 2。

Tab 2 The main mechanism of Astragalus active ingredient regulating TGF-β1/Smads pathway

4 黃芪活性成分在HF中對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制

4.1 NF-κB信號通路在研究HF中的作用核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一種重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，NF-κB通路已被證實(shí)是炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫中的重要通路之一，NF-κB的上游分子因多種因素激活后，使IκB磷酸化并降解，激活NF-κB并移入核內(nèi)在相關(guān)基因的核因子κB受體上結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，對肝臟的氧化應(yīng)激、肝纖維化發(fā)生發(fā)展有著重要的作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，一方面NF-κB可促靜止期HSC活化，當(dāng)靜止期HSC被激活時(shí)，NF-κB的結(jié)合活性增加，可以促進(jìn)HSC活化；另一方面NF-κB可抑制活化期HSC凋亡，抑制IκBα的磷酸化會抑制NF-κB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，促使HSC的凋亡[21]。以上提示NF-κB信號通路與HF在多方面密切相關(guān)。

4.2 黃芪活性成分在HF中調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的機(jī)制血小板衍生生長因子BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)是一種有絲分裂原和纖維化細(xì)胞因子，可通過NF-κB信號通路有效激活HSC，進(jìn)一步加劇肝纖維化。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可通過調(diào)控NF-κB細(xì)胞信號通路，增加p65、p52、p50的表達(dá)，來抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6活化，促進(jìn)HSC細(xì)胞衰老和凋亡。An等[22]對黃芪中芒柄花素、異鼠李素、山柰酚、花萼素、槲皮素5種黃酮類成分抗肝纖維化的機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)5種成分能夠通過調(diào)控NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，來抑制TGF-β1介導(dǎo)的HSC活化，并降低α-SMA蛋白水平，減少ECM的沉積。骨形成蛋白和激活素跨膜抑制劑(BMP and activin membrane bound inhibitor，BAMBI)是被稱為TGF-β的偽受體，可阻滯TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響肝纖維化的進(jìn)展。蔣微[23]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪總皂苷能夠通過調(diào)控NF-κB信號通路，抑制HSC活化和NF-κBp65的磷酸化，降低TNF-α表達(dá)，而增加BAMBI水平來發(fā)揮抗纖維化作用。以上研究表明，黃芪有效成分通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路從減少炎癥反應(yīng)、抑制HSC活化、促進(jìn)HSC衰老和凋亡及減少ECM沉積等方面作用于HF，見Tab 3。

Tab 3 The main mechanism of Astragalus active ingredient regulating NF-κB pathway

5 黃芪活性成分在HF中對PPARγ信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制

5.1 PPARγ信號通路在研究HF中的作用核因子過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)屬Ⅰ型核激素受體超家族成員，可通過抑制或促進(jìn)NF-κB、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子、轉(zhuǎn)錄激活子和激活蛋白-1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而對上述調(diào)控因子介導(dǎo)的信號通路進(jìn)行干擾。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ在正常肝臟的HSC中也有表達(dá)，炎癥或損傷時(shí)HSC被激活，HSC的激活時(shí)PPARγ表達(dá)減少，對維持HSC靜止?fàn)顟B(tài)，抑制HSC的活化具有重要作用。郭晏同等[25]研究表明，PPARγ轉(zhuǎn)錄活性的提高可能會抑制TGF-β1表達(dá)，阻斷HSC中的TGF-β1自分泌環(huán)路，從而減少膠原分泌和HSC的增殖。以上均表明，PPARγ信號通路與HF發(fā)生發(fā)展中HSC活化、HSC增殖、ECM的沉積等方面密切相關(guān)。

5.2 黃芪活性成分在HF中調(diào)節(jié)PPARγ信號通路的機(jī)制肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)是HSC的活化、增殖及過度分泌，HSC激活后會誘導(dǎo)α-SMA的表達(dá)，α-SMA與HSC增殖、肝纖維化程度呈正相關(guān)，是判斷HSC是否激活的重要標(biāo)志。Dong等[26]研究表明，毛蕊異黃酮通過上調(diào)PPARγ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，既能抑制正常HSC中α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)水平，且還能降低TGF-β1刺激下的HSC中二者mRNA的表達(dá)，抑制HSC活化而發(fā)揮抗纖維化作用。成揚(yáng)等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪總黃酮可以上調(diào)PPARγ信號通路的表達(dá)，減輕Hyp含量，改善肝組織的膠原蛋白增生；亦可能是通過調(diào)控PPARγ信號通路和法尼酯衍生物X受體信號通路間的交互作用而抑制肝纖維化。以上研究表明，黃芪有效成分通過PPARγ信號通路抑制HSC活化、抑制膠原合成而在HF中發(fā)揮作用，見Tab 4。

Tab 4 The main mechanism of Astragalus active ingredient regulating PPARγ pathway

6 黃芪活性成分在HF中對其他信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制

Notch信號通路參與調(diào)節(jié)HSCs活化和肝纖維化發(fā)生，其中Notch3的高表達(dá)會促進(jìn)HSC的活化，選擇性干預(yù)Notch3的表達(dá)或許可成為治療肝纖維化的新途徑。Mu等[27]研究表明，黃芪甲苷能夠顯著減少Notch信號通路關(guān)鍵分子Notch2/3/4mRNA及蛋白表達(dá)，抑制Notch信號通路的活化，減少肝組織TGF-β1和α-SMAmRNA表達(dá)，降低肝組織中羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量，而抑制肌成纖維細(xì)胞的活化和積聚，改善膽汁性肝纖維化程度。蛋白酶激活受體2(protease activated receptor 2，PAR2)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，PAR2不僅可誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生，還可激發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)而加重肝臟損傷。李芬等[28]在糖尿病肝纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，黃芪總皂苷可通過調(diào)控PAR2信號通路，下調(diào)p38MAPK、p-p38MAPK蛋白水平，降低炎癥水平，改善肝纖維化程度。前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)是一種含有二十個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸，PGE2可通過EP2/AC-cAMP途徑實(shí)現(xiàn)抑制PDGF刺激的HSC增殖反應(yīng)。劉浩[29]在免疫性肝纖維化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可調(diào)節(jié)PGE2/EP2/cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增加EP2的表達(dá)，升高細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，對TGF-β1誘導(dǎo)HSCs膠原合成的進(jìn)行抑制，而發(fā)揮抗免疫性肝纖維化作用。以上提示黃芪可調(diào)控Notch、PAR2、PGE2/EP2/cAMP信號通路作用于HF，見Tab 5。

Tab 5 Astragalus active ingredient regulates Notch，PAR2，PGE2/EP2/cAMP signaling pathways

7 信號通路間的相互作用

細(xì)胞傳導(dǎo)通路是一個(gè)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，在黃芪作用于HF的通路中，一方面TGF-β1可誘導(dǎo)p38MAPK信號傳導(dǎo)通路的活化；另一方面p38MAPK信號表達(dá)被激發(fā)后，會競爭性抑制Smad2/3向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，阻斷TGF-β1信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。HSC中的TGF-β1自分泌環(huán)路的阻斷可受PPARγ轉(zhuǎn)錄的影響，PPARγ轉(zhuǎn)錄活性的提高可抑制TGF-β1的表達(dá)[25]。外源性PGE2可抑制HSC中COX-2基因的表達(dá)，促進(jìn)PPARγ的表達(dá)，而抑制肝纖維化[30]。PPARγ可通過直接結(jié)合p50/p65亞基，來抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄和DNA合成，使NF-κB活性下降而完成抑制炎癥反應(yīng)；相反Notch1信號通路的激活是上調(diào)NF-κBp50/p65的表達(dá)，下調(diào)IκBα的表達(dá)，而增加NF-κB的DNA結(jié)合活性，引起下游一系列基因的活化[27]。p38MAPK信號通路的激活能激活NF-κB通路，促進(jìn)其下游的細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生；而PAR2信號通路被激活后，可以下調(diào)p38MAPK、p-p38MAPK蛋白水平，減輕炎癥反應(yīng)[28]。不同的信號傳導(dǎo)通路之間存在相互協(xié)同或相互拮抗作用機(jī)制，黃芪的多成分可能會通過特定的細(xì)胞信息作用于多種靶細(xì)胞，與不同靶細(xì)胞的受體結(jié)合，形成相互作用網(wǎng)絡(luò)，顯示出從多靶點(diǎn)、多途徑、多層次相互作用的機(jī)制特點(diǎn)，見Fig 2。

Fig 2 The cellular signaling pathway mechanism of Astragalus against hepatic fibrosis

8 小結(jié)

本研究通過對黃芪活性成分治療HF機(jī)制中所涉及到的細(xì)胞信號通路予以梳理，發(fā)現(xiàn)其可通過調(diào)控p38MAPK、TGF-β1/Smads、NF-κB、PPARγ、Notch、PAR2、PGE2/EP2/cAMP多條信號通路，發(fā)揮減輕肝臟炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抑制肝星狀細(xì)胞活化、促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡、抑制肌成纖維細(xì)胞合成、減少細(xì)胞外基質(zhì)合成等作用，達(dá)到防治HF的作用，顯示出從多靶點(diǎn)、多途徑、多層次相互作用的機(jī)制特點(diǎn)。

目前，黃芪在HF的治療方面取得一定的進(jìn)展，但黃芪活性成分治療HF所涉及的相關(guān)信號通路的相關(guān)研究還存在一些局限性，如多數(shù)研究集中在經(jīng)典通路探討；研究所構(gòu)建的肝纖維化模型比較單一，可從HF不同發(fā)病機(jī)制開展模型構(gòu)建；此外，信號通路間聯(lián)系機(jī)制研究不斷深入，可深入剖析探索相關(guān)通路間的作用機(jī)制，把通路的相互調(diào)節(jié)、相互拮抗或抑制的作用機(jī)制與HP發(fā)生發(fā)展相聯(lián)系。研究相關(guān)信號通路之間的聯(lián)系機(jī)制，更好的發(fā)揮中藥多靶點(diǎn)、多途徑、多層次的優(yōu)勢，為黃芪抗肝纖維化提供強(qiáng)有力的支撐依據(jù)及新的思路可能是需關(guān)注的重點(diǎn)。