組蛋白去乙酰化酶3
——預防器官缺血/再灌注損傷的關鍵靶點

高明朗，賴 凱，付庭呂，李 寧，耿 慶

(武漢大學人民醫院胸外科，湖北 武漢 430061)

缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IRI)是全球范圍內導致患者死亡的主要原因之一[1]，包括心、腦、腎、肝和肺的急性器官損傷。IRI是由器官缺血和再灌注導致的病理性損傷過程，其特點是強烈的促炎反應，包括白細胞遷移、細胞因子釋放、微血管血栓形成和組織細胞死亡[2]。大多數急性器官IRI患者因為沒有特定的治療方法，只能接受臨時器官支持或替代治療，因此，針對IRI的早期預防及尋找合適的治療靶點是至關重要的。

組蛋白乙酰化和去乙酰化修飾是近年來研究的熱點，組蛋白作為真核細胞染色質中的主要蛋白質組分，可以通過穩定染色質結構來調節基因表達，因此，染色質組蛋白的乙酰化水平在基因的表觀遺傳學調控和細胞的生理功能調節中具有關鍵作用[3]。組蛋白乙酰化和去乙酰化修飾最早由Allfrey于1964年最早提出[4]，組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase, HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDACs)通過調節組蛋白N端賴氨酸殘基的乙酰基，進而調控染色質結構和基因表達，許多證據表明，HDAC3在急性器官損傷，尤其是IRI過程中發揮了關鍵的作用[5]。本文綜述了HDAC3在部分器官IRI發生發展中的作用，并討論了其潛在的分子生物學機制及治療價值。

1 HATs和HDACs

組蛋白作為核小體重要的組成部分，其翻譯后修飾會影響染色質的結構和基因表達。組蛋白乙酰化和去乙酰化水平受HATs和HDACs之間的相互調節而保持動態平衡[6]。HATs通過將乙酰輔酶A的乙酰基轉移到N末端內部賴氨酸殘基的ε-氨基來催化組蛋白的賴氨酸乙酰化，乙酰基的加入破壞了DNA和組蛋白之間的靜電連接作用，通過中和賴氨酸正電荷，進而改變了染色質結構和基因表達，HDACs介導組蛋白的去乙酰化修飾來調節染色質的凝聚和轉錄抑制[6]。

HDACs在哺乳動物體內可分為4類，Ⅰ類HDACs包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8，大部分存在于胞核中，其中，HDAC3可以從胞核轉移到胞質中。Ⅱ類HDACs包括Ⅱa 類HDACs(HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9)和IIb類HDACs(HDAC6和HDAC10)，其中Ⅱa類HDACs可在胞核和胞質之間穿梭。Ⅲ類HDACs因為與酵母菌轉錄抑制因子Sirt2序列同源，也被稱為sirtuins，主要包括SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7。Ⅳ類HDACs僅包括1個成員(HDAC11)，其主要在胞核中表達。

2 HDAC3的結構和功能

2.1 HDAC3的結構所有Ⅰ類HDACs成員都具有相似的結構，不同于HDAC1、HDAC2的是，HDAC3能夠與核受體輔阻遏物(nuclear receptor corepressor, NCoR)以及類視黃醇和甲狀腺激素受體沉默介質(silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptors, SMRT)相結合，維持染色質結構和基因組穩定性，因而HDAC3基因對高效的DNA復制和DNA損傷控制至關重要[7]。

2.2 HDAC3的功能核受體作為基因開關，通過激活信號依賴性轉錄因子來調控基因轉錄，反過來，轉錄因子整合激素、代謝和環境信號后，向特定的基因組序列招募各種輔抑制因子和輔激活因子[8]。HDAC3含有核受體輔阻遏物，包括NCoR和SMRT，與無配體的核受體結合后可以直接阻遏基因表達。NCoR和SMRT復合物含有WD40重復蛋白，如TBL1XR1和TBL1X，這些復合物將19S蛋白酶體和泛素化機制招募到組蛋白中[9]。G蛋白通路抑制物2(G protein pathway suppressor 2, GPS2)是NCoR和SMRT復合物的另一個核心元件[10]，然而，GPS2的作用機制尚不清楚。在某些情況下，HDAC3也可以間接激活基因表達，即核受體介導的配體結合使輔阻遏復合物失活并招募輔激活因子，從而通過組蛋白乙酰化修飾促進基因轉錄。

3 HDAC3在器官損傷中的作用

3.1 大腦缺血性卒中是一種潛在且致命的心腦血管疾病，通常由腦血管中的血栓引起，在世界范圍內具有較高的發病率和死亡率。腦血管持續閉塞會阻礙局部腦組織氧氣和葡萄糖的供應，腦低灌注和再灌注過程最終會導致神經性炎癥、細胞壞死和繼發性組織損傷[11]。Ⅰ型干擾素(interferons, IFNs)調控促炎因子表達和先天免疫反應，因此，IFNs或其上游調節因子等可能有助于預防血管閉塞引起的腦IRI。環狀GMP-AMP(cGAMP)合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)-干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)通路是IFNs通路和先天性免疫應答雙鏈DNA(dsDNA)的關鍵調控因子。小膠質細胞是一種存在于中樞神經系統的先天免疫細胞，是IRI所致神經炎癥的主要效應細胞，研究發現小膠質細胞敲除cGAS后可顯著減輕腦IRI，而特異性缺失HDAC3的小鼠也表現出cGAS基因和蛋白水平低表達，以及STING和IFN-γ水平的降低。機制上，HDAC3通過將位于K122處的p65發生去乙酰化，從而促進p65的核累積，來調控cGAS的轉錄[12]。此外，研究顯示，HDAC3的抑制劑RGFP966通過抑制小膠質細胞中黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2, AIM2)炎癥小體的激活，從而預防腦IRI[13]。暴露于脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的原代小膠質細胞經HADC3抑制劑處理后，與未處理組相比Toll樣受體(toll-like receptors, TLR)和STAT3/5信號通路相關基因表達存在明顯差異[14]。眾所周知，糖尿病能顯著增加腦血管閉塞的風險，是缺血性腦卒中的主要危險因素之一，研究顯示，HDAC3通過上調大腦和肌肉的Arnt-like 1(brain and muscle ARNT-like-1, Bmal1)基因表達，從而降低由糖尿病誘導的小鼠腦IRI的風險[15]。然而，HDAC3調控Bmal1表達的能力是否依賴于組蛋白去乙酰化水平尚不完全清楚。

最近研究表明，抑制HDAC3表達可以激活JAK1/STAT3信號通路改善腦IRI，這一過程是通過miR-19a抑制SDC1改善內皮細胞功能實現的。同時，腦IRI的修復過程往往伴隨著神經元干細胞(neural stem cells, NSCs)的自我更新，研究證實在小鼠腦IRI模型中，miR-421靶向PINK1并限制其在NSCs中的表達，進一步抑制HDAC3磷酸化并增強FOXO3乙酰化，從而促進NSCs的自我更新[16]。這些結果表明，HDAC3在腦IRI病理生理過程中扮演著重要的角色，選擇性抑制HDAC3可能對腦IRI具有保護作用，但確切機制需要進一步的臨床數據研究驗證。

3.2 心臟心肌梗死(myocardial infarction, MI)是冠狀動脈粥樣硬化，造成一支或者多支冠狀動脈管腔狹窄和心肌供血不足，阻礙了氧氣和營養物質的供應，從而導致心肌組織損傷和細胞死亡的過程[17]。非編碼RNA在心肌IRI中有重要的調節作用，體外活性氧刺激心肌細胞和體內缺血/再灌注模型共同表明，長鏈非編碼RNA牛磺酸上調基因1(taurine up-regulated gene 1, TUG1)通過結合miR-132-3p，上調HDAC3從而抑制抗氧化基因Bcl-XL、Prdx2和Hsp70的表達，介導心肌細胞氧化損傷[18]。此外，在模擬心肌IRI模型中，HDAC3通過對核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)亞基p65去乙酰化調控抑制NRF2-ARE活性，促進氧化應激誘導的心肌壞死[18]。研究表明周期蛋白依賴激酶2(cyclin-dependent kinases 2, CDK2)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其異常激活與心肌梗死和心力衰竭有關。HDAC3抑制劑RGFP966也可以通過促進miR-19a-3p的表達來降低心肌中CDK2的表達，然而HDAC3調控miR-19a-3p的作用機制尚不清楚[19]。因此，抑制HDAC3對心臟IRI具有保護作用，其具體機制需要進一步闡明，但心肌細胞中的HDAC3高表達可導致心功能不全和心力衰竭，通過RGFP966治療可降低HDAC3的表達，減輕心肌梗死小鼠的氧化應激和心臟損傷。

3.3 腎臟腎臟IRI在機體休克、腎臟移植、心肺復蘇等疾病疾病及血管內手術等過程中很常見[20]。腎IRI后早期給予非特異性HDAC抑制劑Trichostatin A(TSA)預處理可保護腎功能，并通過上調miR-21基因表達來預防腎纖維化。此外，抑制HDAC6對腎臟IRI耐受性沒有顯著影響，表明Ⅱ類HDAC抑制劑對預防腎臟IRI沒有效果[21]。然而，將HDAC3敲除鼠的腎臟移植到野生型鼠后進行腎IRI模型構建，移植腎臟功能并未明顯改變，敲除HDAC3反而加重了腎IRI纖維化進展，但是抑制同為I類HDACs的HDAC2可明顯改善了腎臟IRI的進程[22]。因此，結合上述TSA保護腎IRI研究，HDAC3對腎缺血/再灌注過程的影響及作用機制仍需進一步研究。

3.4 肺臟肺IRI在肺部手術尤其是肺移植后很常見，大量研究表明內皮細胞炎癥、氧化應激、免疫反應是導致移植后肺IRI的主要原因[23]。Joshi等[24]發現使用HDAC3選擇性抑制劑RGFP966可以抑制內皮細胞炎癥和改善內皮屏障功能。此外，在肺IRI模型中，HDAC非選擇性抑制劑丙戊酸(valproic acid, VPA)通過上調HO-1活性顯著降低肺組織炎癥、氧化應激、凋亡等肺損傷指標[25]。肺IRI常可導致機體和局部劇烈的炎癥反應，而炎癥因子的釋放反過來又可加重肺功能障礙。研究表明巨噬細胞調節的免疫炎癥反應加重了肺IRI，使用HDAC3抑制劑通過抑制NF-κB，從而抑制巨噬細胞中各種致炎細胞因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達，來減緩肺IRI進程[26]。最新研究顯示[27]，LPS刺激并沒有改變HDAC3與去乙酰化依賴基因結合的能力，但增加了HDAC3與轉錄起始位點的結合。在骨髓來源的巨噬細胞中，HDAC3通過與獨立于NCoR1/2復合體的ATF2位點結合，來促進促炎因子的表達，HDAC3的激活會抑制TLR信號通路和巨噬細胞的炎癥反應。這些結果表明，抑制HDAC3可以通過改善內皮細胞功能，抑制氧化應激及巨噬細胞活化來減輕肺IRI。

Fig 1 Mechanism of HDAC3 in preventing organ ischemia-reperfusion injury

雖然HDAC3抑制劑可以通過抑制炎癥來預防肺IRI，但由于HDAC3的酶活性可以反過來調控炎癥，因此，在開發HDAC3靶向藥物時還需要進一步研究。

3.5 肝臟肝IRI會直接損害肝臟活力，在肝移植、切除和外傷等手術中很常見。缺血/再灌注通過復雜的信號通路導致嚴重的肝損傷和炎癥反應。研究表明在SD大鼠肝IRI模型中，組蛋白H3乙酰化水平顯著下降，丁酸干預通過抑制HDAC功能和誘導熱休克蛋白(heat shock proteins 70, Hsp70)的表達保護肝損傷[28]。然而，另有研究顯示，HDAC非選擇性抑制劑VPA和SAHA通過調節p38和JNK通路激活延遲肝臟IRI進程，但最終無法實現肝器官保護效應[29]。這些差異結果可能是由于HDAC抑制劑的選擇和肝IRI模型建立的方式不同導致的。盡管上述的HDAC抑制劑均具有HDAC3抑制功能，但HDAC3在肝IRI過程中扮演的角色仍需在使用HDAC3選擇性抑制劑和HDAC3敲除模型環境下才能更好的驗證。因此，在研究HDAC3肝細胞IRI過程中的作用時，需要合理構建模型。此外，HDAC3對于炎癥的調控作用是否對肝IRI有影響仍需進一步研究。

4 HDAC3的臨床價值

迄今為止，有相關臨床研究也證明了HDAC3在器官IRI中的重要作用。例如，糖尿病合并HDAC3和HDAC9基因表達可加重動脈粥樣硬化并導致中風[30]。這些臨床研究表明HDAC3的基因改變與糖尿病和腦血管病的發生密切相關。然而，很少有臨床研究報道HDAC3在其他類型的器官損傷中的作用。在我們進行臨床實踐之前，有必要獲取更多關于HDAC3的臨床數據，確保IRI患者得到更好的治療。

5 展望和結論

HDAC3是HDAC家族中一個獨特而重要的成員，其催化活性主要取決于核受體輔阻遏復合物的完整性。我們還簡要討論了HDAC3在整合來自環境的各種信號以調節細胞周期、發育、代謝和能量平衡中的作用，以及HDAC3在大腦、心臟、腎臟、肝臟、肺等器官IRI中的作用(Fig 1)，雖然HDAC3在生理條件下是有益的，但病理性HDAC3上調與IRI的發病機制密切相關。

迄今為止，尚未在HDAC3基因中發現導致人類疾病的基因突變，可能是因為HDAC3的基因突變導致胚胎無法存活。然而，HDAC3基因中的許多單核苷酸多態性位點(single nucleotide polymorphism, SNPs)突變已被廣泛報道[30]。我們推測，一些SNPs可能位于增強子內，這些SNPs可能由于核受體或轉錄因子的結合受損而阻礙HDAC3的聚集，從而影響HDAC3的表達。另一個突出的問題是，如何克服鋅依賴性HDAC同工酶的高度結構相似性，來開發出特異性HDAC3抑制劑而非廣譜HDAC抑制劑。因此，未來尚需要開展HDAC3相關的大樣本高質量臨床研究，通過臨床的樣本進行驗證，以推動HDAC3的研究發展。