酮咯酸通過胰島素樣生長因子2信號通路抑制卵巢癌的生長和轉移

馮艷坤，陳治軍

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是一種嚴重威脅世界女性生命的惡性腫瘤，其死亡率居女性癌癥之首［1］。卵巢癌具有高復發率、高侵襲性及易耐藥的特性，以至于其預后極差［2-4］。因此，開發新的治療藥物意義重大。非甾體類抗炎藥物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）目前在一些國家作為止痛劑用于原發性癌癥的手術，酮咯酸為其中之一［5］。胰島素樣生長因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）信號通路在很多腫瘤中均表現出活性異常升高，包括卵巢癌［6-7］。研究表明，酮咯酸可以減少乳腺癌的復發，其在卵巢癌中具發揮抑制癌癥惡化的作用，但是其具體的作用機制與IGF2信號通路之間的關系尚缺乏理論依據。本研究于2019年8月至2020年3月以卵巢癌細胞為研究對象，觀察酮咯酸對卵巢癌細胞遷移侵襲及卵巢癌腫瘤的影響，其揭示其機制與酮咯酸抑制IGF2信號通路活性有關，將可為酮咯酸在卵巢癌治療中的應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料人卵巢癌細胞SKOV3購自美國菌種保藏中心（american type culture collection，ATCC）；無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級BALB∕C裸鼠（18～20 g）30只，購自湖南斯萊克實驗生物有限公司，動物使用許可證號為SCXK（湘）2016-0002，本研究符合一般動物實驗倫理學原則；酮咯酸注射液購自輝瑞公司；IGF2信號通路特異性抑制劑Linsitinib購自MCE；杜氏細胞培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購自Hyclone公司；胎牛血清均購自杭州四季青；細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒購自GLPBIO；Transwell小室購自corning；LipofectamineTM2000購自Invitrogen；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自上海安普公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒購自北京Leagene；電化學發光（electronics components laboratory，ECL）試劑盒和RIPA蛋白裂解液購自碧云天；兔抗人IGF2、胰島素樣生長因子1受體（Insulinlike growth factor 1 receptor，IGF1R）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體及兔抗鼠IGF2、IGF1R和GAPDH多克隆抗體購自武漢博士德。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養卵巢癌細胞SKOV3使用含有10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、5%二氧化碳的細胞培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染與分組SKOV3細胞分為正常對照組（NC組）、不同濃度（0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L）酮咯酸組。NC組細胞正常培養基培養48 h；酮咯酸組細胞分別用含0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L酮咯酸培養48 h。將二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解的1 μmol的Linsitinib處理的SKOV3細胞標記為Linsitinib組，含等量DMSO的培養基處理的SKOV3細胞標記為DMSO組。用脂質 體法 將pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-IGF2轉染 至SKOV3細胞，并用1.00 g∕L的酮咯酸處理48 h，分別標記為酮咯酸+pcDNA 3.1組、酮咯酸+pcDNA 3.1-IGF2組。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞抑制率調整細胞至105個∕毫升，接種到96孔板，置于細胞培養箱中培養48 h。每孔加入CCK-8溶液20 μL，490 nm波長測吸光度（optical density，OD）值。細胞存活率（%）=（1-OD實驗組∕OD對照組）×100%。

1.2.4 Transwell小室檢測細胞遷移侵襲收集細胞，用不含血清的培養基培養12 h，然后取100 μL加入小室上室內。在小室下室加入含有胎牛血清的培養基600 μL。將小室置于細胞培養箱中培養48 h，取出后用棉簽輕輕拭去上室下表面的細胞，然后對細胞進行甲醇固定和結晶紫染色，最后在顯微鏡下對細胞進行拍照，計數。

細胞的遷移和侵襲檢測均按照以上操作方法進行，不同之處在于檢測侵襲所選用的小室膜上表面鋪有基質膠，需要在37℃溫箱進行凝固。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測細胞中IGF2、IGF1R的蛋白表達收集細胞或研磨好的腫瘤組織，用細胞裂解液對其裂解，結束后，用沸水浴法對蛋白進行變性，12 000 rpm，離心5 min，取上清液，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量。將準備好的雙層電泳膠中的梳子輕輕拔出，小心將樣品打入梳子孔，避免產生氣泡。打開電泳槽電源先進性穩流電泳，再進行穩壓電泳。結束后，在轉膜儀上進行低溫轉膜，然后進行脫脂奶粉封閉2 h。最后將稀釋好的兔抗人IGF2（1∶1 000）、IGF1R（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）一抗進行4℃孵育24 h。洗膜3次，在用稀釋好的山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，結束后洗膜。顯影曝光，用ECL顯影試劑盒在暗室中進行顯影、曝光和定影。最后用Quantity One凝膠分析軟件對膠片進行處理，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。

1.2.6 裸鼠成瘤實驗取0.2 mL濃度為1×106個∕毫升的卵巢癌SKOV3細胞，接種至裸鼠右前肢，SPF環境下繼續飼養。接種后1周后，出現肉眼可見的腫瘤。然后把SPF裸鼠分為NC組和酮咯酸組，每組10只。酮咯酸組裸鼠灌胃5 mg∕kg酮咯酸，NC組裸鼠灌胃等量生理鹽水，每3天灌胃1次。每周1次，測量腫瘤的最長直徑a（mm）和最短直徑b（mm），腫瘤體積V=a×b2×0.52計算腫瘤體積（mm3），取平均值。第21天時處死裸鼠，小心剝離腫瘤組織，稱量瘤體質量。蛋白質印跡法檢測組織中IGF2、IGF1R蛋白表達，其中IGF2、IGF1R稀釋度均為1∶1 000。

1.3 統計學方法實驗中所用數據均采用SPSS 21.0軟件進行分析。計量資料用±s表示，多組間多重比較采用one-way ANOVA單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 酮咯酸對卵巢癌細胞的抑制作用NC組、不同劑量（0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L）酮咯酸組細胞抑制率分別為（0.02±0.00）%、（6.99±0.06）%、（23.31±2.11）%、（51.39±6.91）%、（76.14±4.36）%，五組間比較差異顯著（F=639.34，P＜0.001）。與NC組相比，不同劑量（0.10 g∕L、0.50 g∕L、1.00 g∕L、1.50 g∕L）酮咯酸組SKOV3細胞抑制率均顯著升高（P＜0.001），且具有劑量依賴性。由于1.0 g∕L的酮咯酸對SKOV3細胞的抑制率接近50%，故選用1.0 g∕L酮咯酸用于后續研究。

2.2 酮咯酸對卵巢癌細胞遷移和侵襲的影響NC組、酮咯酸組細胞遷移數分別為（103±9）個、（54±5）個，侵襲數分別為（76±6）個、（41±4）個。與NC組相比，酮咯酸組細胞遷移數和侵襲數均顯著降低（t=14.27、14.56；均P＜0.001），見圖1。

2.3 酮咯酸對卵巢癌細胞中IGF2信號通路的影響NC組、酮咯酸組細胞中IGF2蛋白表達分別為1.01±0.06、0.31±0.03，IGF1R蛋白表達分別為0.99±0.08、0.26±0.02。與NC組相比，酮咯酸組細胞中IGF2和IGF1R蛋白表達均顯著降低（t=31.30、26.55；均P＜0.001）。見圖2。

圖2 酮咯酸對SKOV3細胞中IGF2和IGF1R蛋白表達的影響

2.4 IGF2抑制劑對卵巢癌細胞遷移和侵襲的影響與NC組或DMSO組相比，Linsitinib組細胞中IGF2和IGF1R蛋白表達均顯著降低（P＜0.001），細胞遷移數和侵襲數均顯著降低（P＜0.001），而NC組與DMSO組各檢測指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3，4；表1。

圖3 IGF2抑制劑對SKOV3細胞中IGF2和IGF1R蛋白表達影響

表1 IGF2抑制劑對SKOV3細胞中IGF2、IGF1R蛋白表達及遷移和侵襲的影響

表1 IGF2抑制劑對SKOV3細胞中IGF2、IGF1R蛋白表達及遷移和侵襲的影響

注：IGF2為胰島素樣生長因子2蛋白，IGF1R為胰島素樣生長因子1受體蛋白。①與NC組或DMSO組比較，P＜0.05。

組別NC組DMSO組Linsitinib F值P值重復次數9 9 9 IGF2 0.98±0.05 1.00±0.07 0.28±0.02①582.00＜0.001 IGF1R 0.99±0.06 1.02±0.08 0.29±0.02①442.99＜0.001遷移98±9 99±7 63±6①68.36＜0.001侵襲73±6 75±6 51±5①49.36＜0.001

2.5 過表達IGF2逆轉了酮咯酸對卵巢癌細胞遷移和侵襲的抑制作用與酮咯酸組或酮咯酸+pcDNA 3.1組相比，酮咯酸+pcDNA 3.1-IGF2組細胞中IGF2和IGF1R蛋白表達均顯著升高（P＜0.05），細胞遷移數和侵襲數均顯著升高（P＜0.05），而酮咯酸組與酮咯酸+pcDNA 3.1組各檢測指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5，6；表2。

圖5 過表達IGF2逆轉了酮咯酸對SKOV3細胞中IGF2、IGF1R蛋白表達及遷移和侵襲的影響

表2 過表達IGF2逆轉了酮咯酸對SKOV3細胞中IGF2、IGF1R蛋白表達及遷移和侵襲的影響∕s

表2 過表達IGF2逆轉了酮咯酸對SKOV3細胞中IGF2、IGF1R蛋白表達及遷移和侵襲的影響∕s

注：IGF2為胰島素樣生長因子2蛋白，IGF1R為胰島素樣生長因子1受體蛋白。①與酮咯酸對+空載體組比較，P＜0.05。

組別酮咯酸酮咯酸+pcDNA 3.1酮咯酸+pcDNA 3.1-IGF2 F值P值重復次數9 9 9 IGF2 0.31±0.03 0.33±0.04 1.28±0.13①427.69＜0.001 IGF1R 0.26±0.02 0.27±0.03 1.19±0.12①490.53＜0.001遷移52±5 53±5 87±7①108.27＜0.001侵襲44±4 42±4 75±6①135.92＜0.001

2.6 酮咯酸對裸鼠成瘤及IGF2信號通路的影響與NC組相比，酮咯酸組裸鼠腫瘤的質量和體積均顯著降低（P＜0.001），腫瘤組織中IGF2和IGF1R蛋白表達均顯著降低（P＜0.001）。見圖7，表3。

圖7 酮咯酸對裸鼠腫瘤組織中IGF2和IGF1R蛋白表達的影響

表3 酮咯酸對裸鼠腫瘤生長和IGF2和IGF1R蛋白表達的影響∕

表3 酮咯酸對裸鼠腫瘤生長和IGF2和IGF1R蛋白表達的影響∕

注：IGF2為胰島素樣生長因子2蛋白，IGF1R為胰島素樣生長因子1受體蛋白。①與NC組比較，P＜0.05。

組別NC組酮咯酸t值P值重復次數10 10腫瘤灶質量1.01±0.07 0.53±0.05①17.65＜0.001腫瘤灶體積1.00±0.04 0.55±0.05①22.22＜0.001 IGF2 0.99±0.08 0.46±0.04①18.74＜0.001 IGF1R 0.97±0.09 0.52±0.05①13.82＜0.001

3 討論

酮咯酸在癌癥治療中可用于控制癌癥相關的疼痛，并在癌癥手術期間和手術后用作止痛劑［8-9］。隨著分子生物技術的不斷發展，酮咯酸在癌癥中的新功能也不斷被發現。Desmedt等［10］在研究中發現，酮咯酸治療可以明顯的降低原發性乳腺癌治療后的復發率，這是酮咯酸在乳腺癌治療中發現的新功能，為酮咯酸的功能開發提供參考。在卵巢癌的系列研究中報道，酮咯酸可通過直接作用于細胞分裂 控 制 蛋 白42（cell division control protein 42，Cdc42）和Ras相關C3肉毒桿菌毒素底物（Substrates of Ras-associated C3 botulinum toxin，Rac1）參與卵巢癌細胞的遷移侵襲能力的調控［11-12］。最近，Hudson等［13］闡明，反式手性的酮咯酸在疼痛控制中具有功效，順勢手性的酮咯酸可能夠通過Rac1、Cdc42在癌癥中發揮益處，二者在卵巢癌中具有不同的作用靶點。

基于以上研究成果，我們推測酮咯酸對卵巢癌細胞和腫瘤生長應該具有一定的調控作用。本研究檢測了酮咯酸處理的卵巢癌細胞的抑制率發現，酮咯酸可呈濃度依賴性抑制卵巢癌細胞，且可明顯抑制卵巢癌細胞的遷移和侵襲；重要的是，酮咯酸還可以抑制體內裸鼠成瘤的生長，這說明酮咯酸在卵巢癌中確實具有抑制癌癥進一步惡化的功能，這個實驗結果與相關報道結果一致［14］。深入研究，通過蛋白質印跡法檢測酮咯酸處理的卵巢癌細胞中IGF2信號通路關鍵蛋白IGF2、IGF1R的表達發現，酮咯酸可下調IGF2、IGF1R表達，抑制IGF2信號通路的活性，猜測IGF2信號通路可能參與酮咯酸在卵巢癌中的功能。

IGF2信號通路具有多種生長因子受體，包括胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）、胰島素受體（insulin receptor，IR），這些受體在與它們各自的胰島素生長因子配體IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ結合后被激活，并在腫瘤的發展、存活和化學治療中起重要作用［15-17］。在許多臨床前研究中，抗IGF-1R∕IR靶向策略被證明可有效減少卵巢癌的生長［18］。Tian等［19］在研究中發現，胰島素樣生長IGF2信號通路通過右美托咪定的介導對卵巢癌大鼠免疫功能及癌細胞侵襲遷移產生影響。Gao等［20］在卵巢癌的研究中發現，上調IGF2能夠促進卵巢癌的進一步惡性化發展。由此可見，IGF2信號通路在卵巢癌中的功能已得到肯定，推測其與酮咯酸的功能之間應該也存在一定聯系。

本研究檢測了酮咯酸處理的卵巢癌細胞中IGF2信號通路的活性發現，酮咯酸可抑制該通路的活化，這也說明了酮咯酸在卵巢癌中發揮抗癌作用。進一步研究發現，抑制IGF2信號通路能夠促進卵巢癌細胞的遷移和侵襲，而激活IGF2信號通路則能夠逆轉酮咯酸對卵巢癌細胞的遷移侵襲抑制作用，這個結果說明了不僅酮咯酸能夠抑制IGF2信號通路的活性，相反，IGF2信號通路也可以反向逆轉酮咯酸對卵巢癌細胞遷移侵襲的抑制作用。為了更充分的揭示酮咯酸在卵巢癌中與IGF2信號通路之間的作用關系，我們又進行了體內裸鼠成瘤實驗發現，酮咯酸不僅可抑制裸鼠體內卵巢癌腫瘤的生長，還可抑制IGF2信號通路的活性。

綜上所述，酮咯酸可抑制卵巢癌細胞的遷移侵襲和腫瘤的生長，其機制與失活IGF2信號通路相關，為酮咯酸用于卵巢癌的臨床治療提供一定的理論依據。

（本文圖1，4，6見插圖1-7）