紫草素促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用機(jī)制研究

楊雙，俞思全

食管癌是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，早期臨床特征不典型、診斷難度大，多數(shù)病人確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展至中晚期、部分病人錯(cuò)過(guò)了手術(shù)切除的時(shí)機(jī)，通過(guò)放化療雖然能夠殺傷癌細(xì)胞、縮小瘤體體積、延長(zhǎng)生存時(shí)間，但病人的總體預(yù)后仍較差、5年生存率不理想［1-2］。近年來(lái)，中藥的抗癌作用受到越來(lái)越多關(guān)注，多種中藥材的活性成分被證實(shí)能夠抑制癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。紫草素是中藥紫草中的活性成分，已有研究表明紫草素對(duì)胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期具有調(diào)控作用［3-5］。食管癌的發(fā)生發(fā)展與癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的失控密切相關(guān)，但紫草素是否調(diào)控食管癌細(xì)胞的上述惡性生物學(xué)行為尚未明確。基于此，本研究將以食管癌Eca109細(xì)胞為對(duì)象，在2019年1月至2020年6月開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，具體分析紫草素促進(jìn)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用及機(jī)制，旨在為今后研究食管癌新的治療藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料食管癌Eca109細(xì)胞購(gòu)自ATCC公司，紫草素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）購(gòu)自Sigma公司，Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒［異硫氰酸熒光素（FITC）∕碘化丙啶（PI）雙染法］購(gòu)自上海生工公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成研究所，RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天公司，活化胱天蛋白酶（cleaved caspase-3）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、磷酸化磷酸肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組給藥Eca109細(xì)胞在含有10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中貼壁培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化后在培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%后進(jìn)行分組給藥。對(duì)照組用不含藥物的DMEM處理，紫草素組用含有0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0 μmol∕L紫草素的DMEM處理，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1組用含有2.0 μmol∕L紫草素和10 μg∕L IGF-1的DMEM處理，每個(gè)處理調(diào)節(jié)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，連續(xù)處理24 h。

1.2.2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)取“1.2.1”中分組處理后的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×105∕mL，按照Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒（FITC∕PI雙染法）進(jìn)行操作，分別孵育Annexin V-FITC和PI，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)取“1.2.1”中分組處理后的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5×105∕mL，用-20℃無(wú)水乙醇固定過(guò)夜，次日按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作、孵育PI后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.4 蛋白表達(dá)量檢測(cè)取“1.2.1”中分組處理后的細(xì)胞，加入RIPA裂解液、提取細(xì)胞中的蛋白，將蛋白樣本與上樣緩沖液混合，加入SDS-PAGE后電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在室溫用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1 h，在4℃用1∶1 000稀釋的cleaved caspase-3、cyclin D1、p-PI3K、p-AKT抗體或1∶5 000稀釋的β-actin抗體孵育PVDF膜過(guò)夜；洗膜3遍后，在室溫用1∶1 000稀釋的HRP二抗孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中得到蛋白條帶，掃描條帶灰度值并以β-actin為內(nèi)參計(jì)算cleaved caspase-3、cyclin D1、p-PI3K、p-AKT的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，五組間計(jì)量資料的比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)Eca109細(xì)胞凋亡率的影響與對(duì)照組比較，0.5 μmol∕L紫草素組、1.0 μmol∕L紫草素組、2.0 μmol∕L紫草素組Eca109細(xì)胞的凋亡率明顯增加（P＜0.05）且隨著紫草素劑量增加，細(xì)胞的凋亡率也相應(yīng)增加；與2.0 μmol∕L紫草素組比較，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1組Eca109細(xì)胞的凋亡率明顯減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 五組食管癌Eca109細(xì)胞凋亡率的比較

2.2 紫草素對(duì)Eca109細(xì)胞中凋亡基因表達(dá)的影響對(duì)照組、0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0μmol∕L紫草素組及2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1組Eca109細(xì)胞中cleaved caspase-3的表達(dá)水平分別為0.41±0.07、0.64±0.14、0.81±0.19、1.02±0.24、0.34±0.08。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對(duì)照組比較，0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0μmol∕L紫草素 組Eca109細(xì)胞中cleaved caspase-3的表達(dá)明顯增加（F=11.31，P＜0.001）且隨著紫草素劑量增加，細(xì)胞中cleaved caspase-3的表達(dá)量相應(yīng)增加；與2.0 μmol∕L紫草素組比較，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1組Eca109細(xì)胞中cleaved caspase-3的表達(dá)明顯減少（t=6.01，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 五組食管癌Eca109細(xì)胞中cleaved caspase-3的蛋白條帶

2.3 紫草素對(duì)Eca109細(xì)胞周期的影響與對(duì)照組比較，0.5 μmol∕L紫草素組、1.0 μmol∕L紫草素組、2.0 μmol∕L紫草素組Eca109細(xì)胞G1期比例明顯增加，S期比例明顯減少（P＜0.05）且隨著紫草素劑量增加，細(xì)胞G1期比例相應(yīng)增加，S期比例相應(yīng)減少；與2.0 μmol∕L紫草素組比較，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1組Eca109細(xì)胞G1期比例明顯減少、G2期比例明顯增加（P＜0.05），S期比例無(wú)明顯變化（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 五組食管癌Eca109細(xì)胞G1期、S期、G2期的比較

表1 五組食管癌Eca109細(xì)胞G1期、S期、G2期的比較

注：IGF-1為胰島素樣生長(zhǎng)因子-1。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與0.5 μmol∕L紫草素組比較，P＜0.05。③與1.0 μmol∕L紫草素組比較，P＜0.05。④與2.0 μmol∕L紫草素組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組0.5 μmol∕L紫草素組1.0 μmol∕L紫草素組2.0 μmol∕L紫草素組2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1組F值P值重復(fù)次數(shù)5 5 5 5 5 G1期24.85±6.58 33.22±7.79①45.41±9.28①②59.39±9.83①②③30.72±8.37④13.29＜0.001 S期63.32±10.93 56.75±8.28①45.47±9.14①②31.75±7.75①②③60.27±12.38④8.64 0.001 G2期11.83±2.84 10.02±1.77 9.12±1.85①8.86±1.34①9.01±1.27 2.13 0.128

2.4 紫草素對(duì)Eca109細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響對(duì)照組、0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0 μmol∕L紫草 素 組 及2.0 μmol∕L紫 草 素+10 μg∕L IGF-1組Eca109細(xì)胞中cyclin D1的表達(dá)水平分別為0.91±0.18、0.80±0.16、0.68±0.13、0.45±0.09、1.02±0.20。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與對(duì)照組比較，0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0 μmol∕L紫草素組Eca109細(xì)胞中cyclin D1的表達(dá)量明顯減少（F=9.37，P=0.001）且隨著紫草素劑量增加，細(xì)胞中cyclin D1的表達(dá)量相應(yīng)減少；與2.0 μmol∕L紫草素組比較，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1組Eca109細(xì)胞中cyclin D1的表達(dá)量明顯增加（t=5.81，P＜0.001）。見(jiàn)圖3。

圖3 五組食管癌Eca109細(xì)胞中cyclin D1的蛋白條帶

2.5 紫草素對(duì)Eca109細(xì)胞中PI3K/AKT通路的影響與對(duì)照組比較，0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0 μmol∕L紫草素組Eca109細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）且隨著紫草素劑量增加，細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)量相應(yīng)減少；與2.0 μmol∕L紫草素組比較，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1組Eca109細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖4，表2。

圖4 五組食管癌Eca109細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的蛋白條帶

表2 五組食管癌Eca109細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT表達(dá)量的比較

表2 五組食管癌Eca109細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT表達(dá)量的比較

注：p-PI3K為磷酸化PI3K，p-AKT為磷酸化AKT。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與0.5 μmol∕L紫草素組比較，P＜0.05。③與1.0 μmol∕L紫草素組比較，P＜0.05。④與2.0 μmol∕L紫草素組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組0.5 μmol∕L紫草素組1.0 μmol∕L紫草素組2.0 μmol∕L紫草素組2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1組F值P值重復(fù)次數(shù)5 5 5 5 5 p-PI3K 0.92±0.19 0.81±0.14①0.44±0.08①②0.20±0.07①②③1.19±0.25④25.67＜0.001 p-AKT 0.87±0.20 0.75±0.14①0.40±0.08①②0.23±0.05①②③1.05±0.23④23.52＜0.001

3 討論

紫草素的抗癌作用與其促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)將紫草素用于食管癌Eca109細(xì)胞的干預(yù)，旨在發(fā)揮其抗癌作用。細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的異常與食管癌的發(fā)生密切相關(guān)，在使用不同劑量紫草素處理食管癌Eca109細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期G1期的比例明顯增加，細(xì)胞周期S期和G2期的比例明顯減少，說(shuō)明紫草素能夠促進(jìn)食管癌Eca109細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)使細(xì)胞周期大量停滯于G1期、不進(jìn)入S期及G2期，這與紫草素在其他惡性腫瘤細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用一致，也表明紫草素具有抗食管癌的作用。

Huang、Hu［6］在子宮內(nèi)膜癌及Guo等［7］在肺癌中的研究證實(shí)，紫草素通過(guò)調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）及Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的線(xiàn)粒體途徑凋亡。Bcl-2和Bax是調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體途徑凋亡的關(guān)鍵基因，前者抑制線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素C向細(xì)胞質(zhì)的釋放，后者則促進(jìn)線(xiàn)粒體內(nèi)細(xì)胞色素C向細(xì)胞質(zhì)的釋放；細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，能夠啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)并使有活性的cleaved caspase-3增多，最終增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。在食管癌的發(fā)病過(guò)程中，bcl-2的表達(dá)增多、Bax的表達(dá)減少，癌細(xì)胞的線(xiàn)粒體途徑凋亡受到抑制，進(jìn)而造成了細(xì)胞增殖活力的增強(qiáng)［8-9］。在本研究中，不同劑量紫草素處理食管癌Eca109細(xì)胞后，cleaved caspase-3的表達(dá)明顯增加，與紫草素增加Eca109細(xì)胞凋亡率的作用吻合，進(jìn)一步確認(rèn)了紫草素用于食管癌細(xì)胞干預(yù)的促凋亡作用。

在肺癌及膀胱癌中的研究證實(shí)，紫草素能夠抑制cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞周期發(fā)生停滯［10-12］。CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，與相應(yīng)的激酶CDK4、CDK6形成復(fù)合物后時(shí)細(xì)胞快速通過(guò)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)并大量進(jìn)入有絲分裂期。在食管癌組織中，cyclin D1的表達(dá)明顯增多、加速細(xì)胞周期的作用增強(qiáng)，有利于癌細(xì)胞的有絲分裂［13-14］。在本研究中，不同劑量紫草素處理食管癌Eca109細(xì)胞后，cyclin D1的表達(dá)明顯減少，與紫草素增加Eca109細(xì)胞G1期比例的作用吻合，進(jìn)一步確認(rèn)了紫草素用于食管癌細(xì)胞干預(yù)的細(xì)胞周期阻滯作用。

食管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為受到復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控，其中PI3K∕AKT通路在細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，該通路的激活對(duì)線(xiàn)粒體凋亡基因及細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)均有調(diào)控作用［15-16］。在胃癌、肺癌、白血病細(xì)胞中，紫草素均對(duì)PI3K∕AKT通路的激活具有抑制作用［3，17-18］。本研究在使用不同劑量紫草素處理食管癌Eca109細(xì)胞后，細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT的表達(dá)明顯減少，表明紫草素能夠抑制食管癌細(xì)胞中PI3K∕AKT通路的激活，這也可能是紫草素促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的可能機(jī)制。為了驗(yàn)證這一機(jī)制，PI3K∕AKT通路的激動(dòng)劑IGF-1被用于細(xì)胞處理，紫草素與IGF-1聯(lián)合使用后，紫草素促進(jìn)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯、調(diào)節(jié)凋亡基因及細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的作用均發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，表明紫草素促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用與抑制PI3K∕AKT通路的激活有關(guān)。

綜上所述，紫草素具有促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用，該作用與抑制PI3K∕AKT通路激活有關(guān)，今后紫草素有望成為治療食管癌的輔助藥物，但仍需更多的在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。