蘿卜硫素對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌保護作用及色氨酸-犬尿氨酸通路的影響

王帥，朱超男，鄔鵬宇，崔志成，趙長全

心肌缺血再灌注損傷是心血管疾病在缺血發生后，血流恢復所引起的心肌損傷，是心血管疾病中常見的病理現象，長時間缺血后恢復血液供應時，局部炎癥增加，導致繼發性損傷［1-2］。長期缺血再灌注損傷引起的細胞損傷可能導致細胞凋亡、自噬、壞死。因此，研究再灌注損傷誘導的細胞死亡的具體機制，可以對其臨床治療提供新的治療靶點。蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）又稱萊菔硫素，不僅有良好的抗癌活性，對缺血再灌注誘導的心肌細胞損傷也具有保護作用，但其具體作用機制尚不完全清楚［3-4］。色氨酸（tryptophan，TRP）是一種必需氨基酸，是神經遞質和其他關鍵的生物合成中間體，在機體代謝功能中起著至關重要的作用［5］。犬尿氨酸（kynurenine，KYN）途徑是哺乳動物TRP代謝的主要途徑［6］，研究顯示，炎性或應激因子誘導吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）可以激活TRP轉化為KYN，參與心血管疾病發生過程［7］，研究報道，TRP∕KYN在心肌梗死病人的自身免疫炎癥反應有關，抑制TRP∕KYN表達可有效緩解心肌損傷［8］。然而關于TRP∕KYN在心肌缺血再灌注損傷中的作用研究報道較少，本研究于2019年7月至2020年6月，通過觀察SFN對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷的影響，初步探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠購自北京生命科學研究所動物實驗中心，8周齡，體質量250 g左右，合格證號為SYXK（京）2015-0002，適應性飼養1周后，進行后續實驗。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 試劑及儀器蘇木-伊紅染液（上海舜百生物科技有限公司，貨號SBT10001）；SFN（成都格純生物醫藥有限公司，貨號4478-93-7）、白細胞介素（IL）-1β ELISA試劑盒（貨號ml028514）、IL-6 ELISA試劑盒（貨號ml102828）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試 劑 盒（貨 號ml002095）均購自上海酶聯生物科技公司；TUNEL試劑盒（碧云天生物技術研究所，貨號C1086）；兔源單克隆B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白（Bax）抗體（貨號ab32503）、兔源單克隆B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗體（貨號ab692）、兔源多克隆活化胱天蛋白酶3（cleaved-capase3）抗體（貨號ab214430）、兔源單克隆IDO抗體（貨號ab235902）均購自abcam公司；生物顯微鏡（日本尼康公司，型號e200）；凝膠成像系統（美國伯樂公司，型號1708280）。

1.3 實驗方法

1.3.1 心肌缺血再灌注損傷大鼠模型構建及實驗分組將SD雄性大鼠隨機分為四組，假手術（Control）組、模型（I∕R）組、SFN低（I∕R+L SFN）、高（I∕R+H SFN）劑量組，每組10只。I∕R+L SFN、I∕R+H SFN組術前2 h自尾靜脈分別注射SFN 5 mg∕kg、10 mg∕kg，Control、I∕R組注射等量生理鹽水［4，9］。除Control外，其他大鼠參考文獻［10］制備心肌缺血再灌注損傷模型，用10%水合氯醛溶液（4 mL∕kg）腹腔注射麻醉，大鼠四肢皮下連接心電圖電極，實驗全程記錄Ⅱ導聯心電圖。打開大鼠胸腔，用0號縫合針線在冠動脈左前降支下結扎，當結扎部位以下心肌顏色變暗且心電圖ST段升高，則表明心肌缺血成功，結扎30 min后，剪開縫合線再灌注2 h，缺血區域的心肌顏色變紅，T波波幅開始回落、ST段下降1∕2以上，則再灌注成功。Control大鼠手術中只在左側冠狀動脈的前降支下穿線，不結扎。

1.3.2 標本采集術后24 h后，采集各組大鼠尾靜脈血5 mL，1 800 r∕min離心10 min取血清，儲存于-80℃冰箱待測；腹腔注射10%水合氯醛麻醉，處死大鼠，分離心肌組織，剪取約1.0 g用于提取組織蛋白，儲存在-80℃冰箱中備用，剩余心肌組織用4%多聚甲醛溶液固定，做常規石蠟切片，備用。

1.3.3 各組大鼠血清中炎性因子檢測取“1.3.2”中血清，用ELISA試劑盒分別檢測IL-1β、IL-6、TNF-α含量，具體操作步驟參考其說明書。

1.3.4 HE染色觀察各組大鼠心肌組織病理變化將“1.3.2”中常規石蠟切片，脫蠟至水化，行HE染色，每張切片選取5個視野，光學顯微鏡下觀察心肌組織病理學改變。

1.3.5 原位末端標記技術（TUNEL）檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況將“1.3.2”中常規石蠟切片，脫蠟至水化，PBS漂洗3次，血清封閉30 min，加TUNEL工作液，避光孵育1 h，具體操作步驟參考TUNEL試劑盒說明書進行，凋亡細胞為陽性其細胞核呈棕黃色或褐色，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡數目，用Image Pro Plus軟件進行分析，每張切片選取5個視野，根據公式凋亡指數=凋亡細胞∕總細胞數×100%，記錄各組大鼠心肌細胞凋亡情況。

1.3.6 檢測各組大鼠心肌組織中TRP、KYN濃度取“1.3.2”中各組大鼠心肌組織0.5 g冰浴進行研磨勻漿，離心取上清液置于透析帶內，加透析液，于4℃搖床透析36 h，取透析液100 μL于離心管中，離心14 000 r∕min，10 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜儀進行分析，色譜柱為Agilent TC-C18（250 mm×5 mm，5 μm），乙腈為流動相，流速1.0 mL∕min，在紫外波長為280 nm檢測TRP色譜，紫外波長為360 nm檢測KYN色譜，根據TRP、KYN標準曲線，計算TRP、KYN濃度及KYN∕TRP比值。

1.3.7 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、cleaved-capase3、IDO蛋白表達情況取“1.3.2”中各組大鼠心肌組織0.5 g提取蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，取50 μg蛋白變性，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、孵育一抗（抗Bax、Bcl-2、cleaved-capase3、IDO、GAPDH抗體，1∶1 000）4℃過夜，次日加二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，加ECL化學發光劑進行顯色，用GAPDH作內參，Image J軟件進行灰度分析。

1.4 統計學方法用SPSS 22.0軟件進行分析，數據用±s表示，多組數據間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SFN減少血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的生成I∕R組較Control IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高（均P＜0.05）；I∕R+L SFN、I∕R+H SFN組較I∕R組IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低，且呈劑量依賴（P＜0.05）。見表1。

表1 SFN對大鼠血清中炎性因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的影響∕（μg∕Ls）

表1 SFN對大鼠血清中炎性因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的影響∕（μg∕Ls）

注：Control為假手術組，I∕R為模型組，I∕R+L SFN為蘿卜硫素低劑量組，I∕R+H SFN為蘿卜硫素高劑量組。①與Control組相比，P＜0.05。②與I∕R組相比，P＜0.05。③與I∕R+L SFN組相比，P＜0.05。

組別Control I∕R I∕R+L SFN I∕R+H SFN F值P值鼠數10 10 10 10 IL-1β 116.84±10.05 297.32±13.12①235.13±14.24①②208.76±16.56①②③299.59＜0.001 IL-6 398.76±20.31 657.34±25.17①595.16±30.02①②482.34±30.55①②③184.74＜0.001 TNF-α 210.04±12.56 483.16±20.31①376.42±28.23①②287.39±27.05①②③263.48＜0.001

2.2 SFN減輕對大鼠心肌組織病理癥狀Control大鼠心肌細胞形態結構完整，排列整齊，纖維結構排列規則；與Control相比，I∕R組大鼠心肌細胞破碎、壞死，細胞排列不規則，心肌纖維斷裂，伴有炎性細胞浸潤；與I∕R組相比，I∕R+L SFN、I∕R+H SFN組大鼠心肌細胞上述病理癥狀明顯減輕。見圖1。

2.3 SFN減少大鼠心肌細胞凋亡與Control相比，I∕R組大鼠心肌細胞凋亡指數顯著升高（P＜0.05），心肌組織Bax、IDO、cleaved-capase3蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05；圖4）；與I∕R組相比，I∕R+L SFN、I∕R+H SFN組大鼠心肌細胞凋亡指數依次降低（P＜0.05），心肌組織Bax、cleaved-capase3、IDO蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖2，3，表2。

圖3 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、cleaved-capase3、IDO蛋白表達

表2 SFN對大鼠心肌組織Bax、Bcl2、capase3、IDO蛋白表達的影響

表2 SFN對大鼠心肌組織Bax、Bcl2、capase3、IDO蛋白表達的影響

注：Control為假手術組，I∕R為模型組，I∕R+L SFN為蘿卜硫素低劑量組，I∕R+H SFN為蘿卜硫素高劑量組，Bax為B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，cleaved-capase3為活化胱天蛋白酶3，IDO為吲哚胺2，3-雙加氧酶。①與Control組相比，P＜0.05。②與I∕R組相比，P＜0.05。③與I∕R+L SFN組相比，P＜0.05。

組別Control I∕R I∕R+L SFN I∕R+H SFN F值P值鼠數10 10 10 10凋亡指數1.07±0.08 32.85±3.13①21.32±2.57①②16.64±1.02①②③397.37＜0.001 Bax 0.67±0.04 0.95±0.03①0.86±0.03①②0.77±0.02①②③151.84＜0.001 Bcl2 1.03±0.06 0.66±0.04①0.72±0.03①②0.87±0.02①②③168.62＜0.001 cleaved-capase3 0.64±0.04 0.92±0.02①0.84±0.03①②0.73±0.02①②③182.93＜0.001 IDO 0.84±0.02 1.02±0.04①0.97±0.03①②0.91±0.01①②③80.44＜0.001

2.4 SFN降低大鼠心肌組織TRP、KYN表達水平與Control相比，I∕R組大鼠心肌組織TRP、KYN濃度、KYN∕TRP比值顯著升高（P＜0.05）；與I∕R組相比，I∕R+L SFN、I∕R+H SFN組大鼠心肌組織TRP、KYN濃 度、KYN∕TRP比 值 依 次 降 低（P＜0.05）。見表3。

表3 SFN對大鼠心肌組織TRP、KYN的影響

表3 SFN對大鼠心肌組織TRP、KYN的影響

注：Control為假手術組，I∕R為模型組，I∕R+L SFN為蘿卜硫素低劑量組，I∕R+H SFN為蘿卜硫素高劑量組，TRP為色氨酸，KYN為犬尿氨酸。①與Control組相比，P＜0.05。②與I∕R組相比，P＜0.05。③與I∕R+L SFN組相比，P＜0.05。

組別Control I∕R I∕R+L SFN I∕R+H SFN F值P值鼠數10 10 10 10 TRP∕（pmol∕L）402.23±23.55 783.75±30.32①654.62±28.35①②527.30±27.09①②③358.13＜0.001 KYN∕（pmol∕L）215.31±20.03 567.54±28.18①446.57±25.46①②312.73±23.28①②③397.56＜0.001 KYN∕TRP比值0.54±0.03 0.72±0.02①0.68±0.02①②0.59±0.01①②③150.19＜0.001

3 討論

再灌注是治療缺血性心臟病的主要方法，但再灌注會引起組織的持續損傷，心肌細胞的凋亡和炎癥反應是心肌缺血再灌注損傷的關鍵過程［11］。心肌缺血再灌注損傷發病機制較為復雜，研究顯示，再灌注損傷是由于炎癥細胞因子表達增加引起的，IL-1β、IL-6是促進炎性因子，TNF-α是一種細胞信號轉導蛋白，可促進炎癥介質的表達，共同調控機體炎癥反應［12］。本研究發現，I∕R組較Control大鼠心肌細胞破碎、壞死，細胞排列不規則，心肌纖維斷裂，伴有炎性細胞浸潤，血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高，與申震等［13］研究結果一致，提示心肌缺血再灌注引起心肌組織發生炎癥反應和損傷。因此，改善心肌缺血再灌注損在缺血性心臟病的治療中具有重要意義。SFN是一種異硫氰酸酯，具有抗氧化活性，對心血管疾病有治療作用。Bonetto等［14］研究顯示，SFN能夠減輕炎癥反應，調節局部缺血后心室功能。本研究發現，SFN治療后較I∕R組大鼠心肌細胞上述病理癥狀明顯減輕，血清中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量依次降低，提示SFN可以抑制炎性因子分泌，緩解心肌組織炎癥反應和心肌損傷。

細胞凋亡是促炎性程序性細胞死亡，抑制細胞凋亡可以減輕再灌注損傷［15］。Bcl-2是抑制細胞凋亡因子，Bax通過激活cleaved-capase3引起細胞凋亡，在細胞凋亡過程中起著重要作用［16］。Peng等［17］研究顯示，SFN可以抑制細胞凋亡，對心肌具有保護作用。本研究發現，與I∕R組相比，SFN治療后較I∕R組大鼠心肌細胞凋亡指數、促凋亡相關蛋白Bax、cleaved-capase3表達顯著降低，抑凋亡蛋白Bcl-2表達顯著升高，提示SFN通過調控凋亡相關蛋白表達，抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡。

TRP-KYN是機體色氨酸分解代謝的主要途徑，參與免疫性疾病、神經精神性疾病、心血管疾病等疾病的發生［18-19］。IDO是KYN途徑催化TRP降解的限速酶，由促炎性刺激和T輔助細胞相關細胞因子TNF-α、IL-6等誘導參與細胞凋亡［20］。研究顯示，TRP-KYN通過調控巨噬細胞、T細胞、B細胞等免疫細胞介導炎癥、免疫激活等反應在心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病中發揮重要作用［21］。楊夢等［22］研究發現，通過調節大鼠體內氨基酸代謝、能量代謝及氧化應激反應，可以有效緩解高血壓心力衰竭大鼠尿液代謝的異常。Baumgartner等［23］研究顯示，通過TRP-KYN介導的信號傳導是參與調節血管炎癥的重要機制。本研究發現，I∕R組較Control大鼠心肌組織TRP、KYN濃度、KYN∕TRP比值、IDO蛋白表達顯著升高，SFN治療后較I∕R組大鼠心肌組織TRP、KYN濃度、KYN∕TRP比值、IDO蛋白表達依次降低，提示TRP、KYN濃度、KYN∕TRP比值和IDO蛋白表達與心肌缺血再灌注損傷有關，SFN可以抑制IDO、TRP、KYN、KYN∕TRP表達，推測SFN可能通過抑制TRP-KYN信號通路，減少心肌細胞凋亡，緩解機體炎癥反應，對心肌損傷有保護作用。

綜上所述，SFN可能通過抑制TRP-KYN信號通路，緩解機體炎癥反應，減少心肌細胞凋亡，對心肌損傷有保護作用，但其具體作用機制仍需進一步研究，補充SFN對心肌梗死損傷等多方面進行補充驗證。

（本文圖1，2見插圖1-3）

圖1 各組大鼠心肌組織的病理變化（HE染色×200） 圖2 各組大鼠心肌細胞的凋亡檢測（TUNEL染色×200）