保康茶葉沖泡過程對咖啡因釋放量影響

尹夢穎，王 穎，戴玙格，李歡歡，范文瑩

（湖北文理學院食品科學技術學院，湖北襄陽 441053）

0 引言

咖啡因（C8H10N4O2）是一種甲基黃嘌呤的生物堿，其化學名是1,3,7 -三甲基黃嘌呤或3,7 -二氫-1,3,7 -三甲基-1H -嘌呤-2,6 -二酮，可以從茶葉、咖啡果等植物中提煉而得，也可以通過化學合成進行制備[1-3]。適量使用咖啡因可以起到祛除疲勞、興奮神經的作用，在臨床上常用來治療神經衰弱、昏迷復蘇的癥狀。但是，大劑量或長期使用咖啡因會損害肝、胃、腎等內臟器官，誘發呼吸道炎癥、婦女乳腺瘤等疾病，并且易引發成癮性，一旦停止使用就會出現精神萎頓、渾身乏軟等各種戒斷癥狀，甚至導致吸食者下一代智力低下、肢體畸形等嚴重問題[1]。因此，咖啡因被列為受國家管制的精神藥品[4]。咖啡因的攝入量可分為以下等級：成人每天攝入80～250 mg 咖啡因（1.1～3.5 mg/kg·d-1）為低攝入量，300～400 mg（4～6 mg/kg·d-1）為中攝入量，超過500 mg（7 mg/kg·d-1）為高攝入量[5-7]。

茶葉是中國傳統飲品，品種產地各不相同，咖啡因含量也存在差別。由于茶葉中咖啡因的攝入主要通過開水浸泡溶出，因此沖泡次數對茶葉中咖啡因的釋放量存在影響，研究泡茶過程對茶水中咖啡因釋放量的影響對健康飲茶具有重要意義。高效液相色譜法是在經典液相色譜法的基礎上發展而來的色譜分離技術，根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離，具有高柱效、速度快、分辨率高、靈敏度高、柱子可反復使用、樣品量消耗少、易回收等優點[8-16]。

因此，以保康產地綠茶為研究對象，建立了高效液相色譜分析方法用于研究泡茶過程對保康產地茶葉中咖啡因釋放量的影響。對高效液相色譜分離檢測條件進行了優化考查，并對分析性能進行評價，將其用于考查泡茶過程對咖啡因釋放量的影響，從而為健康泡茶飲茶提供建議。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

保康茶葉，產自湖北省襄陽市保康地區；咖啡因標準品，南京森貝伽生物科技有限公司提供；甲醇（色譜純）、乙酸（分析純），西隴科學股份有限公司提供；超純水。

準確稱取10.0 mg 咖啡因標準品，用甲醇溶解定容至10 mL，配制為1 000 mg/L 的咖啡因母液，置于-4 ℃中冰箱冷藏備用。不同濃度的咖啡因標準溶液均由1 000 mg/L 咖啡因母液經超純水逐級稀釋定容而得。

1.2 儀器及設備

LC-20ADXR 型高效液相色譜儀，島津企業管理（中國）有限公司產品；AL204 型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；KQ-500E 型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司產品；便攜真空泵，武漢恒信世紀科技有限公司產品。

燒杯、玻璃棒、容量瓶、量筒、移液槍、稱量紙、0.45 μm 微孔濾膜、砂芯過濾裝置、注射器等。

2 試驗方法

2.1 高效液相色譜條件優化

選擇ODS-C18型反相柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm）為分離色譜柱，甲醇∶0.05%乙酸水溶液的混合溶液為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測器為SPD-M20A 紫外檢測器，進樣量20 μL。分別對流動相比例和檢測波長進行優化，選擇對咖啡因分離檢測的最優條件。

2.2 方法分析性能研究

在最優試驗條件下，計算信噪比為3 時的咖啡因濃度，即為方法檢出限（LOD）。通過高效液相色譜法檢測重復檢測相同咖啡因樣品，計算咖啡因峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD，n=7），即為方法重現性。根據咖啡因濃度和峰面積的線性關系繪制擬合標準曲線，得出線性范圍、線性方程與線性相關系數R2。對茶水樣品進行咖啡因加標回收試驗，計算加標回收率，考查方法的準確性。

2.3 茶水樣品的制備

根據大眾飲茶習慣，稱取1 g 干燥的保康茶葉樣品（精確至0.001 g），加入50 mL 沸水，浸泡5 min后收集第一道茶水；繼續加入50 mL 沸水，浸泡5 min后收集第二道茶水，依次類推收集每次的茶水，并標記對應沖泡次數。取1 mL 茶水，加入20%的甲醇水溶液，定容至10 mL，經0.45 μm 濾膜過濾后用高效液相色譜分離檢測。通過工作曲線法計算茶水中的咖啡因含量。

3 結果與分析

3.1 色譜條件的優化

3.1.1 檢測波長的選擇

在不同檢測波長條件下對0.5 mg/L 咖啡因標準溶液進行檢測，檢測波長分別為270，275，280，286 nm。

檢測波長對咖啡因峰面積的影響見表1。

表1 檢測波長對咖啡因峰面積的影響

由表1 可知，檢測波長為275 nm 時的咖啡因峰面積最大，說明此波長下咖啡因信號響應最強，因此選擇275 nm 為最佳檢測波長。

3.1.2 流動相的選擇

考查流動性中甲醇和0.05%乙酸水溶液的體積比分別為20∶80，25∶85 和30∶70 時的色譜分離效果。

流動相構成對咖啡因保留時間的影響見圖1。

圖1 流動相構成對咖啡因保留時間的影響

由圖1 可知，甲醇和0.05%乙酸水溶液的體積比對咖啡因保留時間及峰形具有明顯影響。隨著流動相中甲醇比例的增加，咖啡因的保留時間逐漸提前，且峰寬更窄。因此，選擇甲醇和0.05%乙酸水溶液的體積比為30∶70 作為流動相。

3.2 方法分析性能評價

3.2.1 方法檢出限

將配制好的咖啡因母液分別用超純水稀釋到0.025，0.035，0.050，0.075，0.500 mg/L，在3.1 以優化好的色譜條件下進行檢測。最優色譜條件為選擇ODS-C18柱(4.6 mm×150.0 mm，5 μm) 為分離色譜柱，甲醇∶水∶乙酸體積比30∶70∶0.05 的混合溶液為流動相，SPD-M20A 紫外檢測器，檢測波長275 nm，柱溫30℃，進樣量20 μL。計算不同咖啡因濃度下的儀器信噪比，其中儀器信噪比接近等于3 時的咖啡因濃度即為儀器檢出限（LOD），即0.028 mg/L。

3.2.2 方法精密度

配制質量濃度為0.5 mg/L 的咖啡因標準溶液，在最優色譜條件下重復進樣7 次，計算峰面積RSD為0.54%。取第一道茶水樣品，在最優色譜條件下重復進樣7 次，計算峰面積RSD 值為0.28%。

方法精密度考查見表2。

表2 方法精密度考查

表2 結果所示，該方法對咖啡因標準品及實際樣品均有很好的檢測精密度，重復進樣的結果誤差小。

3.2.3 咖啡因標準曲線的線性回歸

將咖啡因母液分別用超純水稀釋到0.05，0.20，0.50，2.00，5.00，20.00，50.00，100.00，200.00 mg/L，根據咖啡因質量濃度和色譜峰面積繪制擬合標準曲線。

咖啡因標準曲線見圖2。

圖2 咖啡因標準曲線

由圖2 可知，方法線性方程為Y=72 441X-1 122.4，線性范圍為0.10～200 mg/L，線性相關系數R2為0.999 2。由此可見，在線性范圍內，咖啡因的質量濃度和峰面積具有良好的線性關系。

3.2.4 咖啡因加標回收試驗

為考查該方法用于實際樣品分析的準確性，對茶水樣品進行了加標回收試驗。加標質量濃度分別為2.0，5.0，10.0 mg/g。

加標回收試驗結果見表3。

表3 加標回收試驗結果

由表3 可知，3 個加標質量濃度對應的咖啡因回收率在94.30%～111.50%，可以滿足茶水實際樣品檢測對準確度的要求。

3.3 沖泡過程對咖啡因釋放量影響

參考大眾日常飲茶習慣，模擬茶葉沖泡過程，通過工作曲線法對每次茶水中的咖啡因含量進行測定。

沖泡過程對茶水中咖啡因含量的影響見表4。

表4 沖泡過程對茶水中咖啡因含量的影響

由表4 可知，每次經沸水浸泡的茶水中均有咖啡因釋放，且每次釋放量約為上一次的50%，通過計算可知1 g 保康產地綠茶中咖啡因總釋放量為36.85 mg。按照成人咖啡因的攝入量等級標準可知，為避免過量攝入咖啡因造成健康危害，成人每天取保康綠茶2.2～6.8 g 泡飲（即成人每天攝入80～250 mg 咖啡因為低攝入量），盡量不超過13.6 g（即咖啡因超過500 mg 為高攝入量）。此外，還可以通過棄去第一道茶水的方式避免咖啡因的過量攝入。

4 結論

建立了高效液相色譜法用于保康綠茶沖泡過程對咖啡因釋放量的影響研究。通過優化色譜條件，建立檢出限低、重現性好、結果準確的高效液相色譜用于茶水中咖啡因的檢測，并對沸水沖泡過程的咖啡因釋放量變化進行考查。通過模擬大眾飲茶習慣，對每次沖泡的茶水進行檢測，結果發現，茶水中咖啡因的釋放量逐次減半，基于此可為飲茶方式和飲茶量提出合理健康的建議。