七彩神仙魚卵母細胞的組織和超微結構觀察

英娜，王元，唐成婷，宋學峰，秦搏，吳艷慶，楊立國，朱建輝，房文紅

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.平邑縣農業農村局，山東 臨沂 273300；3.上海彰顯漁業專業合作社，上海 201700）

關鍵字：七彩神仙魚；卵母細胞；組織觀察；超微結構觀察；卵膜

七彩神仙魚（Symphysodon aequifasciatus），隸屬于鱸形目（Perciformes）、慈鯛科（Cichlidae）、盤麗魚屬（Symphysodon），原產于南美洲的亞馬遜河流域。它色彩鮮艷、體態優美而倍受觀賞魚愛好者的青睞，素有“觀賞魚之王”的美稱。目前七彩神仙魚在國內雖已經開展工廠化養殖，研究主要針對生長[1]、胚胎發育[2]、疾病防控[3,4]和養殖水質變化[5]等，關于其性腺發育的研究鮮有報道。

卵巢、卵子的發育是動物繁殖的基礎，系統研究卵巢、卵子的發育結構特征，對于判別卵子的發育狀態，提高七彩神仙魚的人工增養殖技術水平具有重要意義。本研究采用組織切片及透射電鏡技術，觀察養殖七彩神仙魚卵巢的發育，概括描述卵母細胞發育的大致過程及各時期的形態特點，旨在完善和豐富七彩神仙魚的研究內容，并為其人工繁殖技術提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用30 尾1～2 齡雌七彩神仙魚，體長12.3～16.2 cm，體高15.1～17.3 cm，取自上海市青浦區一家養殖場內（121.1°E，31.2°N），養殖水溫28～30℃。

1.2 方法

取出七彩神仙魚雌魚卵巢組織，參照常曉晴等[6]的方法固定，用石蠟包埋切片，Masson 染色，再用Olympus BX51 多功能顯微鏡觀察，Image-Pro Plus 5.1 軟件拍照，進行圖像采集，顯微測量卵母細胞及其核的大小。核質比的計算公式如下：PN=Vn/（Vc-Vn），其中Vn 為核的體積，Vc 為細胞的體積，體積V=4/3πr3。

1.3 電鏡樣品制作與觀察

為觀察七彩神仙魚卵母細胞的超微結構，參照林國輝等[7]的方法進行戊二醛固定，沖洗、脫水、包埋、定位、切片、染色等，最后將切片置于FEI-Tecnai12 型透射電鏡下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 卵母細胞的發育過程

根據卵母細胞生長特點、核仁數目、濾泡細胞、液泡形成、卵黃物質的積累等將卵母細胞的發育分為六個時相：第Ⅰ時相的卵原細胞時期；第Ⅱ時相的濾泡細胞生成期；第Ⅲ時相的放射帶形成期；第Ⅳ時相的卵黃顆粒形成期；第Ⅴ時相的液泡大量生成期；第Ⅵ時相的成熟卵泡時期。卵母細胞卵徑、核徑、核質比等信息參見表1。

表1 七彩神仙魚各時相卵母細胞的卵徑、核徑、核質比及核仁數量Tab.1 Egg diameter,nuclear diameter,nucleocytoplasm ratio and nucleolus number of oocytes in brow discus Symphysodon aequifasciatus at various phases

第Ⅰ時相：卵原細胞由卵巢生殖上皮細胞分裂而來，形態不一，多呈梨形或橢圓形，直徑29.8～77.9 μm,細胞核為圓形，染色質為絲網狀，細胞質中顆粒分布均勻，染為深紅色，呈強嗜酸性（圖1-a）；第Ⅱ時相：卵母細胞生長速度加快，直徑可達125.4 μm，細胞質隨細胞體積增大，染色變淺，但整體染色均勻。細胞核呈圓形，核仁由第Ⅰ時相的均勻分散于核內，轉為沿核膜內表面附著，同一卵巢切面內的核仁數6～11 個。卵母細胞外表面出現單層濾泡細胞，緊貼卵母細胞表面（圖1-b～c）。第Ⅲ時相為大生長時期的卵母細胞，體積繼續增加，直徑145.6～282.5 μm。核膜出現波紋狀內折，濾泡細胞與卵膜之間逐漸形成放射帶（圖1-d）。第Ⅳ時相：卵母細胞體積由于胞內物質的快速合成而繼續增長，細胞質中沿質膜出現染色較深的卵黃顆粒，并由質膜向核膜方向增多，卵母細胞外側濾泡細胞數量繼續增多，核膜逐漸溶解，胞質內出現零散液泡。第Ⅴ時相的卵母細胞生長速度減緩。核膜溶解，核仁完全消失，卵黃顆粒幾乎充滿整個卵母細胞，液泡數量迅速增多，沿卵膜分布；卵母細胞外側濾泡細胞增至2～3 層，卵母細胞與濾泡細胞之間的放射帶明顯增厚（圖1-f）。第Ⅵ時相卵母細胞發育為成熟卵泡，細胞體積增加至最大值，直徑最高可達354.1 μm（圖1-g～h），卵泡細胞內外物質積累豐富，為隨時排卵做準備。液泡數量繼續增多，胞內卵黃顆粒大量增加而被擠至胞膜內緣，形成皮質液泡層，此液泡層不斷擴展。排卵后的卵母細胞，由于卵黃顆粒被吸收而形成許多空泡（圖1-g～h），直至卵母細胞內的卵黃顆粒被完全吸收（圖1-i）。

圖1 卵母細胞發育的組織學觀察Fig.1 Histological observation of oocyte development phases

2.2 放射帶的形成與卵膜的變化

由組織切片可觀察到，放射帶形成于濾泡細胞層之后。電鏡切片觀察發現（圖2），第Ⅲ時相之前的卵母細胞沒有放射帶（圖2-a），此時期的細胞質電子密度較大，染色較深，卵膜結構簡單。在第Ⅲ時相之后，隨著卵母細胞外濾泡細胞數量的增多，互相之間的物質交換頻繁，逐漸出現了放射帶結構（圖2-b），卵母細胞內開始出現卵黃顆粒積累，胞膜處由于物質交換形成液泡（圖2-c）。隨著卵母細胞的發育，放射帶的厚度逐漸增加（圖2-d），第Ⅲ時相的放射帶剛剛形成（←），厚度約1.2～1.9 μm，而第Ⅳ時相的放射帶（→）厚度為2.1～3.5 μm，此時放射帶由濾泡細胞突起的分泌物質及卵母細胞膜上管道運輸的物質形成，大量的物質運輸為卵母細胞內卵黃物質的形成做準備。第Ⅳ時相以后的卵母細胞，濾泡細胞含有分泌顆粒而被稱為顆粒細胞（Gc）（圖2-f），自內向外依次為放射帶、顆粒細胞和基層（Bi）。

圖2 卵膜放射帶結構的超微結構觀察Fig.2 Ultrastructural observation of oocyte envelop and zone radiate

3 討論

3.1 產卵類型

根據卵巢內卵母細胞的發育，可將魚類分為同步產卵型或非同步分批產卵型[8]。非同步型產卵魚類的卵巢內可同時存在Ⅰ-Ⅳ期不同發育階段的卵母細胞。人工養殖的雌七彩神仙魚一般9 個月以上才可達性成熟。養殖條件適宜時每尾魚每個月可產卵1～2 次，每次產卵數約150～300 粒，可連續產兩年。組織切片觀察可見，本研究中的七彩神仙魚的卵巢內同時具有多個不同發育時期的卵母細胞：同一時期的卵巢內，既有已經產卵的空卵泡，卵黃物質積累時期的Ⅳ、Ⅴ時相的卵母細胞，也有放射帶形成期的Ⅱ、Ⅲ時相卵母細胞。不均等發育的卵母細胞形成非同步型連續型產卵，這與甌江光唇魚（Acrossocheilus fasciatus）[9]相似。

3.2 卵母細胞的發育

根據七彩神仙魚卵母細胞的發育特點，可將其分為六個時相，經歷了小生長期、大生長期與成熟期，這與大多數鱸形目的魚類相似。第Ⅰ和Ⅱ時相的卵母細胞，細胞開始生長，體積逐漸增大，但是，此時的細胞生長不是最快，從卵徑的數值可以看出，處于小生長時期。與銀鯧（Pampus argenteus）、花（Hemibarbus maculatus Bleeker）相似[10]。七彩神仙魚的濾泡細胞也是第Ⅱ時相開始形成。從第Ⅲ時相開始，細胞進入大生長時期，細胞體積快速增長，核質比明顯降低，在第Ⅲ時相開始出現卵黃顆粒、液泡。

卵黃物質是受精卵早期發育的主要營養物質。它由肝臟產生的卵黃蛋白原經血液運輸至卵母細胞轉化而來[8]。卵黃物質最先出現于質膜附近，然后慢慢積累至細胞質整個區域。在大生長時期，卵黃物質的迅速積累也是細胞體積生長的主要原因。

液泡并不是空泡（又稱卵黃泡），是電子致密度較低的絮狀物[7]。大多數關于卵母細胞發育的研究中，描述液泡的很少，僅練青平等[9]關于甌江光唇魚的研究中描述較為詳細：第Ⅱ時相早期的液泡僅一層，大小不一，逐漸增加至多層，并由胞質邊緣向中央擴展，直至第Ⅱ時相晚期，液泡幾乎充滿細胞質。這一點與七彩神仙魚非常相似。最開始大小不一的液泡，隨著胞內卵黃物質的積累，被擠至胞質邊緣，逐漸積累至多層，最后將胞質與胞膜隔開。所不同的是，本研究中的液泡最早見于第Ⅲ時相早期。第Ⅴ、Ⅵ時相是卵母細胞成熟期，此時的細胞體積生長有所緩慢，但是，胞內外物質變化依然明顯，卵黃物質充滿整個胞質為隨時排卵準備。而在排卵之后，胞內的卵黃物質逐漸被卵子吸收，慢慢變成“空泡”。

3.3 卵膜的結構與發育

卵膜是指卵膜細胞發育過程中附著于細胞表面的非原生質膜結構。不同硬骨魚類的卵膜成分命名不一：例如施氏鱘（Acipenser schrenckii）[11]的卵膜（由外向內）稱為：膠膜層、卵黃外膜及卵黃內膜，而膜與膜之間相互作用形成的縱向管道和微管被稱為放射帶。鱖的卵膜[7]由鞘膜層、放射帶及卵黃膜層組成。鲇（Silurusasotus linnaeus）卵膜成分則是透明帶及卵母細胞形成的內、外放射帶。雖然命名不同，但是組成結構十分相似，主要是卵母細胞自身分泌及與濾泡細胞相互作用形成的區域結構，主要的功能就是為卵母細胞內卵黃物質的積累提供物質交換。

七彩神仙魚的早期卵母細胞表面結構相對簡單，在第Ⅱ時相細胞表面出現零散濾泡細胞，但是，此時胞膜與濾泡細胞層結合緊密。在第Ⅲ時相，卵母細胞表面單層鋪滿濾泡細胞，局部出現雙層。透射電鏡下可觀察到，質膜與濾泡細胞之間出現由膜縱向管道與膜突起形成微管結構組成的放射區域，這一點在花[12]、鱖（Siniperca chuatsi）[7]、鲇[13]的研究中也有相同的描述。隨著胞內卵黃物質合成（第Ⅳ時相以后）的需要，濾泡細胞增加至兩層，分別為內層的含分泌顆粒的顆粒細胞及長而扁平的外層濾泡細胞，兩者之間由膠原纖維組成的基層（Bi），放射帶厚度也在此時迅速增長。直至第Ⅵ時相，卵細胞內卵黃物質合成結束后，細胞成熟，從濾泡膜脫離，放射帶結構消失。放射帶的這一變化與斑馬魚（Danio rerio）[14]、施氏鱘（A.schrenckii）[11]、哲羅魚（Hucho taimen）[15]、黑鱾（Girella leonina）[16]和錦江翹嘴鲌（Culter alburnus）[17]等魚相似。