彭韻霖，唐中，方莉

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，1.產(chǎn)前診斷中心；2.檢驗(yàn)科；3.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，四川 南充 637000)

在精準(zhǔn)醫(yī)療大背景下，晚期肺腺癌患者的治療手段已經(jīng)從傳統(tǒng)的放化療過渡到靶向治療[1]，即針對特定靶點(diǎn)進(jìn)行治療。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是癌癥的重要驅(qū)動因子，EGFR蛋白酪氨酸激酶功能與腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成等密切相關(guān)。因此在治療前應(yīng)明確EGFR基因突變狀態(tài)，再采用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine-kinase inhibitor，TKI)進(jìn)行治療。既往研究結(jié)果顯示，應(yīng)用TKI可改善患者的無進(jìn)展生存時(shí)間(progression-free survival，PFS)，但部分患者在EGFR-TKI治療10個(gè)月后產(chǎn)生耐藥性。研究[2-3]顯示，耐藥患者中，約50%存在EGFR基因20號外顯子第790位點(diǎn)突變(即T790M基因突變)，這是EGFR對TKI耐藥最主要的機(jī)制，其中19-del外顯子缺失突變和21外顯子L858R點(diǎn)突變是EGPR突變中最常見的兩種亞型。明確患者EGFR基因突變狀態(tài)，并在治療過程中監(jiān)測T790M耐藥突變基因的出現(xiàn)，是晚期肺腺癌患者靶向治療的關(guān)鍵。

臨床采用血漿循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)進(jìn)行EGFR基因突變檢測，具有侵襲力低、反復(fù)獲取等優(yōu)勢。但ctDNA在血漿中含量極微，因此迫切需要高靈敏度的檢測方法來檢測血漿ctDNA中的EGFR基因突變狀態(tài)[4]。目前研究[5-8]顯示，Super-ARMS PCR 具有較高的特異度，但其靈敏度相對較低，假陰率較高。據(jù)2016年全國ctDNA基因突變檢測室間質(zhì)量評價(jià)調(diào)查活動結(jié)果報(bào)告顯示，采用二代測序(next-generation sequencing，NGS)法的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果符合率為79.1%、ARMS-PCR符合率為78.6%，而采用數(shù)字PCR的實(shí)驗(yàn)室符合率為100%。因此，應(yīng)用數(shù)字PCR檢測可明顯提高ctDNA基因突變的檢出率。但既往研究多采用微滴數(shù)字PCR對EGFR基因突變狀態(tài)進(jìn)行檢測，僅可檢測突變豐度為0.001%的突變樣本[9-10]。既往研究[11]采用芯片式數(shù)字PCR對使用EGFR-TKI的患者進(jìn)行耐藥突變T790M的監(jiān)測，其相比于NGS具有更高的靈敏度。本研究應(yīng)用基于芯片的數(shù)字PCR產(chǎn)品，將樣本分為20 000個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元，分散于20 000個(gè)微孔集成在一張100 mm2的芯片上，在隔絕外部污染的密閉芯片中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過芯片式數(shù)字PCR對晚期肺腺癌患者血漿ctDNA中EGFR基因突變情況進(jìn)行檢測，借以驗(yàn)證數(shù)字PCR在血漿EGFR基因突變檢測中的臨床可用性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例篩選 選取2017年7月至2017年12月于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的26例按國際肺癌研究協(xié)會(IASLC)(第八版)肺癌TNM分期[12]確診為III～I(xiàn)V期肺腺癌患者為研究對象，患者年齡48～79歲，其余臨床資料包含性別、吸煙史等。患者均由病理活檢確診。本研究經(jīng)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。排除其他腫瘤疾病，且已經(jīng)過靶向治療和新輔助化療患者。

1.1.2 主要儀器與耗材 PAXgene Blood ccfDNA Tube(德國Qiagen公司)、芯片式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(dPCR)分析系統(tǒng)(南京科維思公司)、迷你離心機(jī)、恒溫金屬浴、37 ℃水浴箱、Eppendorf臺式高速冷凍離心機(jī)(德國艾本德公司)、移液器(德國艾本德公司)、微型旋渦混勻器、QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen公司)、DNA Clean&Concentrator-5(Zymo Research公司)、EGFR基因 L858R突變檢測試劑盒(南京科維思公司)、EGFR基因19DEL突變檢測試劑盒(南京科維思公司)、無水乙醇、異丙醇。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 應(yīng)用PAXgene Blood ccfDNA Tube采血管經(jīng)肘正中靜脈收集患者外周血樣本10 mL，1 900×g低速離心15 min，分離血漿于-80 ℃冰箱凍存待用。

1.2.2 血漿ctDNA抽提 將血漿按QIAGEN公司QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取試劑說明提取血漿ctDNA，再采用DNA Clean&Concentrator-5濃縮提純DNA，OD260 nm /OD280 nm=1.8～2.0，放入-80 ℃冰箱凍存待用。

1.2.3 數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn) (1)將所有試劑及樣本置于冰上融化，顛倒混勻、離心后置于管架上，同時(shí)將芯片上樣器打開預(yù)熱，配制L858R和19del反應(yīng)混合液，總體積為14.5 μL，包含7.25 μL數(shù)字PCR反應(yīng)液，0.72 μL EGFR基因19DEL突變檢測反應(yīng)液，6.53 μL DNA樣本，每批樣本包含1個(gè)陰性質(zhì)控品，1個(gè)陽性質(zhì)控品。(2)反應(yīng)芯片的制備：將數(shù)字PCR通用芯片和上樣槽安裝到芯片上樣器上，用移液器將14.5 μL反應(yīng)混合液加入到上樣槽中。按下工作按鈕將反應(yīng)混合液均勻的涂到數(shù)字PCR通用芯片上，將補(bǔ)液器安裝到芯片填充液前端，在芯片表面加入數(shù)滴芯片填充液，以覆蓋整個(gè)芯片表面，蓋上芯片密封蓋，按壓15 s，取下芯片組件，注入芯片填充液，將芯片密封好，并將其置于紫外燈下固化。(3)dPCR擴(kuò)增：將制好的芯片按以下反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增：96 ℃ 10 min，60 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；60 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；10 ℃，保溫待數(shù)據(jù)分析。(4)將芯片在dPCR擴(kuò)增儀中放置10 min后從儀器中拿出，室溫避光靜置15 min，平衡溫度至室溫。平衡后的芯片依次放入dPCR分析儀中，識讀芯片唯一標(biāo)識符并捕獲樣本所有反應(yīng)孔FAM、VIC、ROX通道的熒光信號，ROX通道用于判斷是否有樣本存在，從而確定病例突變狀態(tài)。

1.2.4 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn) FAM陽性孔/(VIC陽性孔+FAM陽性孔)比值>0.1%為陽性，≤0.1%為陰性。

1.2.5 質(zhì)量控制 陽性質(zhì)控品的FAM陽性孔/(VIC陽性孔+FAM陽性孔)比值應(yīng)>0.1%，陰性質(zhì)控品FAM陽性孔/(VIC陽性孔+FAM陽性孔)比值應(yīng)≤0.1%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理。計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，采用Fisher確切概率法；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)字PCR檢測血漿ctDNA EGFR基因突變結(jié)果

26例患者中，檢出基因突變6例，突變檢出率為23.1%，其中19del突變兩例，L858R突變3例，19del及L858R雙突變1例。見表1及圖1。

表1 數(shù)字PCR檢測EGFR基因19del、L858R突變結(jié)果

2.2 血漿ctDNA EGFR突變狀態(tài)與臨床特征的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，EGFR基因突變與患者性別、年齡、吸煙史無相關(guān)性(P>0.05)，而腫瘤分期與EGFR基因突變狀態(tài)有相關(guān)性(P<0.05)。見表2。

表2 血漿ctDNA EGFR突變結(jié)果與臨床特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

EGFR基因是NSCLC的主要驅(qū)動基因，突變較易發(fā)生于亞裔、女性、腺癌、不吸煙或少吸煙的患者，分子靶向藥物TKI靶向治療可有效改善EGFR基因敏感突變攜帶者的預(yù)后[13-14]。19-del和L858R是EGFR最常見的敏感突變位點(diǎn)，19del突變患者臨床首選EGFR-TKI靶向治療，L858R突變患者臨床首選抗血管生成藥物聯(lián)合EGFR-TKI治療。ctDNA是一種可代替腫瘤組織檢測腫瘤特異性改變的樣本，其在取材安全無創(chuàng)、動態(tài)監(jiān)測、不受腫瘤異質(zhì)性的影響有著無可比擬的優(yōu)勢，但其在循環(huán)系統(tǒng)中的豐度極低，易受到高濃度野生型血漿游離DNA的干擾，且呈高度片段化，因此需要靈敏度極高的方法對血漿EGFR基因突變進(jìn)行檢測。

目前，EGFR檢測常見方法有ARMS法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)或NGS技術(shù)等，這些檢測方法要么敏感度有限無法滿足臨床需求，要么操作復(fù)雜、技術(shù)難度高，成本高。數(shù)字PCR是一種可以通過分析血漿ctDNA對低頻突變檢測，從而確定NSCLC患者EGFR基因突變狀態(tài)，對比于常規(guī)ARMS法具有更高的靈敏度。芯片式數(shù)字PCR由于其整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)都在密閉的芯片中進(jìn)行，相較于ddPCR減少了外界污染帶來的影響，同時(shí)其結(jié)果判讀簡單、直觀，更適于臨床工作人員使用，是目前CDFA唯一批準(zhǔn)進(jìn)入臨床檢測的數(shù)字PCR。

本研究基于具有高靈敏度的芯片式數(shù)字PCR法對26例未進(jìn)行抗腫瘤治療的III～I(xiàn)V期肺腺癌患者進(jìn)行血漿19-del和L858R突變位點(diǎn)檢測，共檢測出EGFR基因突變6例，突變率為0.11%～2.23%，其中L858R突變檢出率為15.4%(4/26)，19del突變檢出率為11.5%(3/26)，略低于Yung等[11]的結(jié)果，原因可能為本研究樣本量有限，結(jié)果可能存在偏倚；本研究患者與其存在結(jié)構(gòu)異質(zhì)性(如不同腫瘤分期患者比例不同)。

相關(guān)性分析顯示，EGFR基因突變狀態(tài)與患者性別、年齡、吸煙史無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而腫瘤分期與EGFR基因突變狀態(tài)有相關(guān)性(P<0.05)，與Karachaliou等[15]的研究結(jié)果基本一致，可能是晚期EGFR基因突變狀態(tài)與腫瘤分期相關(guān)。目前研究[16]指出，在不考慮腫瘤組織EGFR基因突變狀態(tài)的晚期NSCLC患者中，對血漿ctDNA進(jìn)行EGFR基因突變檢測，結(jié)合腫瘤分期顯示，IV期病例相較于III期患者血漿EGFR突變檢出率較高，可能是由于不同分期患者于血漿中釋放的ctDNA含量不同所致，進(jìn)一步證實(shí)了血漿ctDNA EGFR基因突變檢出率可能與患者腫瘤分期有關(guān)。

本研究應(yīng)用數(shù)字PCR對ctDNA EGFR突變等位基因和野生型等位基因進(jìn)行絕對定量，突變EGFR/突變EGFR+野生型EGFR的濃度比值定義為EGFR突變豐度。EGFR突變患者中，僅兩例患者19-del突變陽性孔數(shù)>10，信號比值>1%，整體突變豐度水平較低。Yang等[17]研究指出，對于EGFR基因突變豐度>5.15%的患者采用EGFR-TKI具有更好的PFS。Yung等[11]研究顯示，NSCLC部分緩解和完全緩解的患者EGFR突變序列濃度降低，而疾病進(jìn)展患者突變持續(xù)存在。研究提示，應(yīng)用數(shù)字PCR技術(shù)不僅僅局限于指導(dǎo)靶向治療的用藥，還可基于數(shù)字PCR的絕對定量的優(yōu)勢，檢測EGFR突變豐度，通過突變豐度及其變化預(yù)測NSCLC疾病的轉(zhuǎn)歸及EGFR-TKI的療效。

本實(shí)驗(yàn)也存在一定不足：(1)由于樣本量的限制，結(jié)果可能存在偏倚；(2)無法排除由于技術(shù)操作、樣本因素所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果；(3)雖然數(shù)字PCR設(shè)備已獲得CFDA批準(zhǔn)上市，但迄今為止暫無CFDA批準(zhǔn)的數(shù)字PCR檢測試劑盒；(4)由于檢測所需血漿樣本量較大，本實(shí)驗(yàn)僅檢測了19del突變及L858R突變，未明確26例患者中是否存在原發(fā)性T790M耐藥，后續(xù)可在靶向用藥過程中采用芯片式數(shù)字PCR繼續(xù)隨訪患者T790M耐藥突變。

綜上，芯片式數(shù)字PCR在晚期肺腺癌患者的血漿ctDNA中可以檢出EGFR突變，可為臨床醫(yī)生進(jìn)行治療決策提供一定的理論依據(jù)。