豬鞭蟲基于ITS 基因PCR 診斷

黃志堅

（福建省三明市綠色食品發展中心，福建三明 365000）

豬鞭蟲（Trichuris suis）又稱豬毛尾線蟲，屬于無尾感器綱（Aphasmidea）毛尾目（Trichurata）毛尾科（Trichuridea）毛尾屬（Trichuris），蟲體前部細長，后部粗短，形似馬鞭，故也有毛首線蟲或鞭蟲之稱[1-5]。鞭蟲蟲體呈乳白色，前部為食道部，約占細長前部的3/5，內含由1 串單細胞圍繞的食道；后部為體部，約占短粗后部的2/5，內有生殖器和腸管。雌蟲體長40～50mm，尾直、末端呈圓形；雄蟲體長30～40mm，尾部呈螺旋狀卷曲[6]。蟲卵腰鼓狀，兩端有塞，卵殼厚，呈棕黃色。豬鞭蟲的生活史不需要中間宿主，蟲卵或幼蟲在外界發育到具有感染性后直接感染終末宿主。

豬鞭蟲病的感染度較強、較普遍，四季均有發生，但蟲卵在夏季的孵化率和感染率均高于其他季節[7]，寄生的鞭蟲以吸血為主，Layrisse 等[8]報道每條成蟲的日吸血量為0.005mL。感染重者往往導致死亡，對養豬業的健康發展造成一定的威脅[9]。1～4 月齡的仔豬較容易感染和寄生鞭蟲，45 日齡仔豬糞便中即可檢查出蟲卵，4 月齡豬只蟲卵數目和感染率均顯著提高，而對6 個月齡以上的育肥豬和成年母豬的影響較小，且比較少見相關臨床感染報道。少量的豬鞭蟲寄生對豬只造成的健康危害不大，但是嚴重感染時，仔豬則表現出消瘦、血清蛋白降低、貧血、黏膜蒼白、皮膚無彈性、被毛無光澤等臨床癥狀[10]。豬鞭蟲寄生于結腸和盲腸內[11]，蟲體頭部深入黏膜，引起結腸和盲腸的慢性卡他性炎癥，有時還會出現出血性腸炎，通常為瘀斑性出血，剖檢可見結腸和盲腸黏膜有出血性壞死、水腫、結節和潰瘍。

目前寄生蟲的診斷和分析發現，除使用傳統的形態學觀察外，隨著分子生物學方法的成熟應用，PCR擴增和序列分析已成為寄生蟲在分子水平上分類和鑒別的有效手段。為此，本研究采用PCR 方法，擴增疑似豬鞭蟲分離株轉錄間隔區序列（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列并進行測序，BLAST 對比分析，建立豬鞭蟲PCR 診斷方法，為今后豬鞭蟲的鑒別、診斷、防治以及分子流行病學調查等更深層次的研究奠定基礎，以降低豬鞭蟲對養豬業造成的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣品

豬鞭蟲樣品來自福建三明某豬場的保育舍小豬盲腸內，70%酒精保存。

1.2 主要試劑

10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、Taq 酶、蛋白酶K、DL-2000 DNA marker 均購自福州晶泰生物技術有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 蟲體DNA 提取

從70%的酒精保存液中取出一條疑似豬鞭蟲蟲體，剪成4 段，用雙蒸水反復吹打沖洗3 次，用吸水紙吸干蟲體表面的水分。分別置于已滅菌干燥的1.5mL Eppendorf 管中，充分剪碎后用研磨器研磨；加入500μLTES（裂解液）混勻，再加入2μL 蛋白酶K（50mg/mL），充分混勻后，于56℃水浴保溫6h，每2h 搖1 次（充分裂解組織、細胞、消化蛋白等），至體系透亮；加入500μL 酚、氯仿、異戊醇混合液，體積比為25: 24 :1，緩慢顛倒5min 混勻，12000rpm，離心10min，取上清液到已滅菌干燥的1.5mL Eppendorf 管中；加入等體積氯仿、異戊醇混合液，體積比為24 : 1，緩慢顛倒5min 混勻，10000rpm，離心10min，取上層清液到一個已滅菌干燥的1.5mL Eppendorf 管中；加入3 倍體積的-20℃預冷的無水乙醇沉 淀 DNA，置于-20℃冰箱中保存 30min；12000rpm，離心10min，棄乙醇；-20℃保存的75%乙醇洗滌2 次，12000rpm，離心5min，棄乙醇，用濾紙小心吸干Eppendorf 管壁的乙醇，置于超凈工作臺干燥1h 左右；加入適量雙蒸水溶解DNA（30μL），-20℃保存備用。

1.4 PCR 擴增

采用引物序列NC2（5，-TTAGTTTCTTTTCCTC CGCT-3，）和NC5（5，-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3，）[4]，為擴增鞭蟲ITS 及5.8S 基因的保守引物，由上海生工生物工程有限公司合成。預期擴增片段大小約為1500bp，擴增體系為25μL。PCR 反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃復性30s，72℃延伸90s，進行35 個循環，最后72℃后延伸10min。并設不加DNA 模板的陰性對照。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳好的瓊脂糖凝膠于紫外透射儀上觀察并記錄結果。

1.5 PCR 擴增產物測序

將PCR 產物寄到上海生工生物工程股份有限公司測序，然后進行序列比較和分析。

2 結果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結果

PCR 產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳好后可見約1500bp 的條帶，跟預期的目的片段大小一致。DNA 陰性對照無條帶出現（圖1）

圖1 豬鞭蟲ITS 序列PCR 產物電泳圖

2.2 測序序列對比分析

將測序株在線BLAST 比對，通過DNA star 軟件分析測序株與GenBank 上豬鞭蟲的同源性。由圖2 序列分析可以看出，Longyan（本次試驗蟲體序列，標注為“China:Longyan，Fujian Province”）與AM9930 03（China:Miluo，Hunan Province）的同源性達93.3%；與AM993005（China:Yiyang，Hunan Province）的同源性達95.3% ；與AM993006（China:Yangjiang，Guangdong Province）的同源性達94.9%；與AM9930 12（China:Zhanjiang，Guangdong Province）的同源性達94.0%；與GQ301555（Cameroon:Kumba）的同源性高達98.7%。綜上所述，所擴增序列達到預期要求，該測序株為豬鞭蟲。

圖2 DNA star 序列分析

3 討論

對寄生蟲進行分類和鑒定是寄生蟲學研究的基礎和前提，也對防治人、動物和植物的寄生蟲病有重要意義。根據形態學鑒定寄生蟲是傳統的分類和鑒定方法，但是隨著生物種群的進化和發展，形態學在不同發育時期寄生蟲的鑒別及相似蟲體的鑒別存在一定的局限性。近年來，PCR 診斷方法作為一種實用性檢測方法，既保證檢測的準確性，又保證檢測的時效性，是目前應用最普遍的分子生物學工具，該技術因其所具有的敏感性高、特異性強和適合于大規模群體監測的特點，在疾病診斷方面得到了廣泛應用。在寄生蟲分子分類學研究中，利用核糖體DNA 對寄生蟲進行分類學和蟲種進化關系學的研究已經成為國際上普遍的應用方法[12]。ITS 是位于寄生蟲的遺傳物質特別是核糖體DNA（rDNA）的18S 和28S 基因之間區域片段，由于它在種間變異較大，從而可以用作蟲種間以及株間的分類鑒定。在現代分子分類學領域，越來越多地采用rDNA 的內轉錄間隔區（ITS）作為分子標記[13]。羅建勛等[14]對中國境內發現的4種牛巴貝斯蟲和一種牛巴貝斯蟲未定種進行了18S rRNA 基因測序，并將所測序列與GeneBank 上已經發表的牛巴貝斯蟲18S rRNA 比對，研究發現該未定種在基因樹上與卵形巴貝斯蟲在同一枝上，進而確定該未定種屬卵形巴貝斯蟲。張龍現等[15]為了準確、快速鑒別人畜隱孢子蟲的種類，建立了巢式PCR 擴增隱孢子蟲的18S rRNA 基因特殊區域，結果顯示，在18S rRNA 基礎上建立的PCR-RFLP 方法可以有效鑒別隱孢子蟲的種類。

4 結論

該研究對三明地區豬體內分離獲得的疑似豬鞭蟲，應用PCR 技術進行擴增其ITS 序列，擴增產物經測序后，與GenBank 中的AM993003、AM993005、AM993006、AM993012、GQ301555 進行比對，應用DNA star 軟件進行序列分析，同源性分別為93.3%、95.3%、94.9%、94.0%和98.7%，證明該測序株為豬鞭蟲。本研究建立了基于ITS 基因豬鞭蟲的分子診斷方法，研究結果對豬鞭蟲進一步的診斷、鑒定和遺傳變異的研究奠定了基礎，為豬鞭蟲病的臨床診斷和流行病學調查提供了科學依據。