不同生長時期梅花鹿鹿茸代謝組分析

張然然，榮 敏，董依萌，王天驕，邢秀梅*

(1.中國農業科學院特產研究所 特種經濟動物分子生物重點實驗室，長春 130112；2.德州市畜牧獸醫事業發展中心，德州 253000)

鹿茸是一種能夠完全再生的骨質器官，為雄性鹿科動物第二性征。鹿茸生長周期在 100 d左右，呈“S”型生長，最快生長速度可達 2.75 cm·d-1或 300 g·d-1[1]。鹿茸細胞的增殖速率比癌細胞快30倍，但有序、可控，是研究骨骼快速生長、骨質疏松的良好模型。茸尖被認為是鹿茸的生長中心，以軟骨內成骨方式驅動鹿茸的快速生長過程。近些年，利用RNA-seq、iTRAQ、label-free等組學技術對鹿茸的基因、蛋白質表達動態進行了詳細研究，并篩選到了與鹿茸快速生長相關的基因、信號通路[2-5]。

繼基因組、轉錄組、蛋白質組學，又衍生出了代謝組學(metabonomics)，主要研究生物體相對分子質量小于1 000 的內源性小分子代謝物的種類、數量及其在內外因素作用下的變化規律，如氨基酸、脂質、核苷等化合物[6]。與基因組、蛋白質組相比，代謝組更能直觀地反映生物體對環境變化的響應，且可以放大基因組、蛋白質組的微小改變，是對基因組學、蛋白質組學的有力補充與相互印證。目前，代謝組學技術已廣泛應用于中醫藥研究、臨床疾病診斷、化學生態學、環境科學、毒理研究等多個科學領域[7-8]。

隨著質譜技術的不斷發展，代謝組學技術也逐漸應用在鹿茸組分的研究。孫偉麗等[9]、劉文媛等[10]、唐麗昕等[11]利用UPLC-QTOF/MS代謝組學技術，對不同區段鹿茸的內源性小分子代謝進行了鑒定與差異分析；張楠茜等[12]對比分析了鹿茸熱炮制前后的化學組成差異；Su等[13]利用代謝組學技術分析了梅花鹿和馬鹿鹿茸之間的代謝物差異；本課題組前期利用UPLC-QTOF/MS技術對梅花鹿靜脈血與鹿茸血小分子代謝物成分進行了對比分析，發現了天然抗氧化劑-麥角硫因在鹿茸血中含量顯著高于靜脈血[14]。

代謝組學技術不僅可以分析鹿茸組分，也是探究鹿茸復雜生長機制的一種重要技術手段。本研究利用UPLC-QTOF/MS技術對生長25、45、65、100與130 d的梅花鹿鹿茸進行代謝組學研究，分析小分子代謝物在鹿茸生長發育過程中的表達變化，為鹿茸快速生長、骨化分子調控機制的解析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所需的梅花鹿鹿茸取自中國農業科學院特產研究所試驗動物基地。選取體況良好的 4歲齡雄性東北梅花鹿，收取生長25、45、65、100與130 d的鹿茸，每時期樣品分別取自不同的 3 頭梅花鹿做為生物學重復。用 PBS 緩沖液將新鮮鹿茸組織表面的血液與污漬沖洗干凈，然后選取鹿茸的尖部，去除茸皮，并將其切成 1 mm3小塊，用液氮研磨儀研磨成粉末，-80 ℃保存備用。

1.2 主要試劑與儀器

乙腈購自Merck公司，甲醇、乙酸銨購自Honeywell公司(均為LC-MS級別)；質譜儀5600/6600購自AB SCIEX公司，超高壓液相色譜儀1290購自Agilent 公司，低溫高速離心機5430R購自Eppendorf公司；液相色譜柱均購自Waters公司，ACQUITY UPLC BEH Amide column (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)，ACQUITY UPLC HSS B3 column(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)。

1.3 樣本預處理

每份樣品分別稱取80 mg至1.5 mL離心管中，加入800 μL甲醇乙腈水溶液(體積比2∶2∶1)，渦旋混勻30 s，冰上超聲30 min，-20 ℃ 靜置1 h；之后 4 ℃，13 000 r·min-1離心15 min；小心地取出上清溶液，冷凍干燥，甲醇乙腈水溶液復溶。每個樣本各取10 μL混合成QC質控樣本。

1.4 HPLC-MS分析

試驗所用液質聯用系統由Aglient 1290 Infinity LC串聯AB Sciex Triple TOF 5600高分辨質譜儀組成。所使用的色譜柱為Waters的UPLC BEH Amide 色譜柱。柱溫設置25 ℃，正離子掃描模式進樣量3 μL，負離子掃描模式進樣量4 μL。每進6個樣品后加入一個QC樣品。流動相為25 mmol·L-1醋酸銨及25 mmol·L-1氨水的水溶液(A液)，純乙腈(B液)，梯度洗脫程序見表1；整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進樣器中。

利用AB 5600 Triple TOF質譜儀進行一級、二級質譜數據采集。ESI離子源參數設置如下：霧化氣壓：40 Psi，輔助氣壓：80 Psi，氣簾氣壓：30 Psi，溫度：650 ℃，噴霧電壓：5 000 V(正、負兩種離子掃描模式)。二級質譜碰撞能量(35±15)eV。數據采集按照分段模式進行：50～300，290～600，590～900，890～1 200 m·z-1。所采集獲得的數據分別使用自建MetDDA和LipDDA方法，進行代謝物的結構鑒定。

表1 液相洗脫梯度

1.5 數據處理

原始數據經ProteoWizard轉換成.mzXML格式，然后采用XCMS程序進行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。數據經Pareto-scaling預處理后，進行多維統計分析，包括無監督主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)[15]。單維統計分析包括Student’st-test和變異倍數分析。利用 MetaboAnalyst 5.0在線軟件進行代謝物的通路富集分析[16]。代謝物結構鑒定采用精確質量數匹配(<25 ppm)和二級譜圖匹配的方式，檢索自建數據庫。

2 結 果

2.1 試驗質量控制

對比6份相同QC樣本的正、負離子檢測模式下的總離子流圖，結果顯示，各QC樣本的色譜峰響應強度和保留時間基本重疊且基線穩定，說明在整個試驗過程中儀器誤差引起的變異較小(圖1)。采用XCMS軟件對梅花鹿鹿茸樣品的代謝物離子峰進行提取，正離子模式下共提取到保留峰12 063個，負離子模式下提取到8 974個。

2.2 統計分析

分別對各樣品的數據進行Pareto-scaling處理，然后進行樣品間主成分分析(PCA)與層次聚類分析。結果顯示，各時期鹿茸在PC1(34.3%)維度上顯著分離(圖2A)。樣品層次聚類結果顯示，5個時期樣品可以分為兩類(圖2B)，第一類包括25、45、65 d三個時期鹿茸，第二類包括100 與130 d兩個時期鹿茸。

A. 鹿茸樣品PCA分析；B. 鹿茸樣品層次聚類分析A. PCA analysis of antler; B. Hierarchical cluster analysis of antler圖2 不同生長時期鹿茸樣品統計分析Fig.2 Statistical analysis of antler samples in different growth periods

2.3 鹿茸發育過程中代謝物表達動態

為篩選鹿茸不同生長時期的顯著差異表達代謝物，首先進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。OPLS-DA是一種有監督的判別分析統計方法，通過運用偏最小二乘回歸建立代謝物表達量與樣品間的關系模型，來實現對樣品類別的預測；同時通過計算變量投影重要度(VIP)來衡量各代謝物的表達模式對各樣本分類的影響強度和解釋能力。最終設定顯著差異代謝物篩選標準：VIP>1，P<0.05，|fold change|>2。結果共鑒定到171種顯著差異表達代謝物，其中T25vs.T45有39種差異代謝物，T45vs.T65組有7種差異代謝物，T65vs.T100組有70種差異代謝物；T100vs.T130組有84種差異代謝物(圖3)。

圖3 顯著差異表達代謝物Fig.3 Significant differentially expressed metabolites

2.4 差異代謝物分類

差異代謝物匹配到HMDB數據庫的112種化合物，可分為7大類，分別為有機酸及其衍生物類，脂質和類脂質分子，核苷、核苷酸和類似物，有機氮化合物，有機氧化合物，有機雜環化合物以及苯類化合物(圖4)。

有機酸及其衍生物類有39種顯著差異代謝物，其中29種為氨基酸，包括L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、D-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-焦谷氨酸、N-乙酰-L-天冬氨酸、L-天冬氨酸、L-纈氨酸、甘氨酸、L-瓜氨酸、L-絲氨酸、L-蛋氨酸、L-谷氨酸、D-天冬氨酸、L-組氨酸等。除L-焦谷氨酸、L-組氨酸外，其他氨基酸類化合物均在鹿茸生長期表達上調；而L-焦谷氨酸、L-組氨酸、L-肌肽(β-丙氨酰-L-組氨酸)與阿坎酸等有機酸類化合物在100 d含量最高，隨后在130 d時顯著下降。所有有機酸及其衍生物類化合物均在130 d時表達顯著下調。

脂質和類脂質分子是差異代謝物的第二大類，包含了27種差異代謝物。其中13種為脂肪酸化合物，包括羥基異己酸、3-羥基-3-甲基戊二酸、乙酰肉堿、肉豆蔻酸、十五烷酸、cis-9-棕櫚油酸、十七烷酸、油酸、16-羥基棕櫚酸、花生酸、山崳酸、L-棕櫚酰肉堿、硬脂酰肉堿等，其中L-棕櫚酰肉堿在骨化期上調，其他均在生長期上調；6種為類固醇類代謝物，其中鵝去氧膽酸鹽、膽酸在25 d含量上調，甘膽酸在100 d時顯著上調，而膽鈣化醇、甾醇在130 d時顯著上調；此外，還包含有3種類花生酸化合物，15-脫氧-Δ12,14-前列腺素J2、前列腺素H2、前列腺素I2均在130 d顯著上調。

核苷、核苷酸和類似物包含了11種顯著差異代謝物。8種為嘌呤核苷酸，包括脫氧肌苷、肌苷、腺苷、N6-甲基腺苷、鳥苷、黃嘌呤核苷、2-甲基鳥苷、1-甲基鳥苷等，其中肌苷與鳥苷在100 d時含量最高，所有嘌呤核苷酸類代謝物均在130 d時表達顯著下調。有機氮化合物包含了12種差異代謝物，其中組胺、鞘氨醇、鞘氨醇、植物鞘氨醇、亞油酰乙醇酰胺、N-油酰乙醇胺等胺類化合物均在130 d含量顯著上調。

有機氧化合物有11種，主要為碳水化合物或碳水化合物結合物，這些化合物均在130 d時含量顯著下調，包括甘油酸、L-山梨糖、D-甘露糖、α-D-葡萄糖、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖、L-蘇糖酸鹽、D-葡萄糖酸鹽、D-核糖、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰神經氨酸等。有機雜環化合物有8種，其中5-甲基胞嘧啶、二氫胸腺嘧啶、次黃嘌呤、2-羥基腺嘌呤在100 d顯著上調；尿囊素、L-色氨酸在130 d時下調。苯類差異代謝物有4種，其中酪胺、多巴胺、馬尿酸等在130 d下調。

圖4 基于HMDB數據庫的差異代謝物分類Fig.4 Classification of differential metabolites based on HMDB database

2.5 差異代謝物通路富集分析

差異代謝物共顯著富集到13種KEGG代謝通路(P<0.05)，分別為氨酰-tRNA生物合成，組氨酸代謝，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，乙醛酸和二羧酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，嘌呤代謝，甘油磷脂代謝，泛酸和CoA 生物合成，谷胱甘肽代謝等代謝通路(圖5)。組氨酸代謝通路見圖6。

圖5 差異代謝物代謝通路分析Fig.5 Differential metabolite metabolic pathway analysis

代謝物上方的熱圖代表25、45、65、100、130 d的相對含量。紅色代表上調，藍色代表下調Heatmaps above metabolites represent relative amounts at 25, 45, 65, 100, 130 d. Red represents up-regulation, blue represents down-regulation圖6 組氨酸代謝通路Fig.6 Histidine metabolism pathway

3 討 論

鹿茸生長過程可分為生長期與骨化期[17]，其生長速度、相對骨質密度以及基因、蛋白質的表達模式均有顯著差異。本研究發現，生長期與骨化期在代謝組水平也存在顯著差異，且篩選到了171種顯著差異表達代謝物，主要為氨基酸類、脂質、核苷酸類等化合物。

鹿茸中含有豐富的氨基酸，其總量占鹿茸干重的30%～50%，其中天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、精氨酸等氨基酸占氨基酸總量的32.5%～37.2%，這主要是由于膠原蛋白的存在[18]。KEGG富集結果顯示，氨基酸代謝在鹿茸生長發育過程中發生了顯著變化，如組氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝。除L-組氨酸外，其他氨基酸均在鹿茸生長期表達上調。這與前期蛋白質組學研究結果是一致的，參與翻譯起始、蛋白折疊、蛋白轉運等生物學過程的蛋白質在生長期表達上調[2]。另一類在生長期表達上調的化合物為有機酸類，其中檸檬酸、磷酸烯醇式丙酮酸、L-蘋果酸、琥珀酸等都是三羧酸循環的中間產物。三羧酸循環是機體將糖或其他物質氧化而獲得能量的最有效方式，能夠為機體的生命活動提供大量能力。因而，三羧酸循環相關化合物可提供鹿茸快速生長所需的能量供應。

組氨酸代謝是差異代謝物顯著富集通路之一，涉及到了L-組氨酸、組胺、肌肽、鵝肌肽等。組氨酸是合成蛋白質所必需的，在酶的活性位點起著重要作用，如絲氨酸蛋白酶[19]。肌肽與鵝肌肽是由β-丙氨酸和L-組氨酸兩種氨基酸組成的內源性二肽[20]，鵝肌肽可由肌肽-N-甲基轉移酶 1(CARNMT1)催化肌肽形成[21]。肌肽富含在脊椎動物的肌肉和大腦組織中，在體內發揮多種生物效應，包括抗炎[22]、抗氧化[23]、抗衰老[24]、抗糖基化[25]等，也有研究發現肌肽可能通過抑制β-catenin信號通路調控的成骨因子轉錄生成和細胞凋亡，而抑制血管平滑肌細胞鈣化[26]。組氨酸可以在組氨酸脫羧酶的酶解下形成組胺。組胺是一種重要的化學介質，主要由肥大細胞合成，參與胚胎發育[27]、組織再生[28-29]、傷口愈合[30]、免疫[31]、骨代謝[32]。有研究證實，組氨酸脫羧酶敲除OVX(卵巢切除術)小鼠的骨小梁丟失減少。同時，組胺也可以增加破骨細胞和破骨細胞前體的數量，而組胺受體1和組胺受體2的拮抗劑則降低了破骨細胞的招募和骨吸收[33-34]。進一步有研究證明，組胺是通過RANKL-RANK信號通路誘導破骨細胞分化的[35]，而且組胺能通過刺激牙齦成纖維細胞IL-2、IL-4表達升高，間接促使前列腺素 E2的分泌表達。因此，組氨酸代謝通路可能參與了鹿茸快速骨化過程的調控。

脂類化合物在鹿茸生長過程中也發生了顯著差異變化，其中前列腺素H2、前列腺素I2、前列腺素J2等參與了前列腺素生物合成過程。前列腺素H2是所有前列腺素生物合成的第一個中間體，其中前列腺素E2是骨代謝的重要調節劑，體外注射可增加骨小梁表面的成骨細胞數量[36]，誘導新生松質骨形成，促進骨折愈合[37]。Weinreb等[38]發現，前列腺素E2可通過結合EP4受體，激活鞘氨醇激酶，抑制caspase活性，從而增加大鼠骨髓成骨基質細胞的數量。此外，前列腺素E2還可直接刺激成骨細胞分化，或通過刺激成骨細胞中RANKL表達，抑制骨保護素的表達，而間接刺激破骨細胞分化，進而調控骨重塑[39]。因此可以推測，前列腺素合成通路在鹿茸生長發育過程中也同樣發揮重要的作用。

4 結 論

本試驗利用UHPLC-TOF-MS技術對不同生長時期的梅花鹿鹿茸進行代謝組學分析，結果共檢測到了171種顯著差異代謝物，其中L-組氨酸、L-肌肽、組胺、前列腺素等化合物在骨化期表達上調，推測這些化合物可能參與了鹿茸的快速骨化過程。本研究從代謝組水平為鹿茸快速生長與骨化分子機制的探究提供數據支撐。