乙酸鈉對油酸誘導的BRL-3A細胞脂肪變性的影響及機制分析

李 林，宮彬彬，王廣力，趙 梅，張源淑

(1.邢臺學院生物科學與工程學院，邢臺 054001；2.河北醫科大學附屬邢臺人民醫院病理科，邢臺 054031；3. 南京農業大學動物醫學院農業部動物生理生化重點開放實驗室，南京 210095)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種以三酰甘油(triglyceride，TG)在肝蓄積為特征的疾病，近年來，由于脂肪和高糖等攝入增加、激素食品泛濫等因素，使NAFLD發病率逐年增高。NAFLD在雞、狗、豬、牛、羊以及魚等動物也可發生，是各種動物的原發或者繼發性疾病，在雞、鴨的發病率較高，該病不僅影響著養殖業的發展，也會帶來一定的食品安全問題，給禽類養殖業造成嚴重的經濟損失[1]。近年來，NAFLD越來越受到關注，因其發病機制復雜、診斷困難，已成為世界上最常見的慢性肝病。NAFLD通常與高血壓、血脂異常、肥胖、胰島素抵抗、代謝綜合征、2型糖尿病和心血管疾病密切相關[2]。目前，NAFLD沒有有效的治療方案，主要以改變動物的飲食方式為主。

乙酸是一種短鏈脂肪酸(SCFA)，它是由攝入的膳食纖維刺激，經動物盲腸和結腸發酵產生[3-4]。據報道，膳食纖維可以降低餐后血糖反應、血漿膽固醇和三酰甘油濃度以及脂肪儲存[5]。并且，Hara等[6]研究發現含有SCFA的無纖維飲食也能降低血清膽固醇。乙酸除了由結腸細菌發酵產生外，許多食物中均含有乙酸的成分。

肝是動物調節脂質代謝和維持脂質穩態的重要器官，通過肝切片發現，肝含有多種細胞類型，如肝細胞、庫普弗細胞、內皮細胞和成纖維細胞[7]。研究表明，乙酸可以使小鼠肝TG含量降低，脂質氧化基因表達增加[8]。此外，乙酸可激活糖尿病KK-A(y)小鼠肝腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)蛋白，而AMPK作為能量的“傳感器”和“調節器”，對肝的脂質代謝的調節具有重要作用[9]。目前，乙酸在調控肝代謝方面的研究較少，且不深入。因此，本試驗通過油酸誘導BRL-3A細胞建立脂肪變性模型，分析乙酸鈉是否對BRL-3A細胞脂肪變性模型具有調控作用，為乙酸鈉對動物攝食調控及改善肥胖、健康方面的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

大鼠肝成纖維細胞(BRL-3A)購自中國科學院昆明細胞庫，本實驗室凍存。

1.2 主要試劑

乙酸鈉、油酸購自美國Sigma公司；TG試劑盒、油紅O染色試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶試劑盒均購自南京建成生物技術有限公司；P-AMPK-兔/AMPK-兔抗體均購自艾博抗上海貿易有限公司；山羊抗兔IgG購自上海生物工程有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；DMEM培養基、胎牛血清和青霉素/鏈霉素購自南京澤優生物科技有限公司。

1.3 BRL-3A細胞脂肪變性模型建立

1.3.1 BRL-3A細胞的培養與處理 BRL-3A細胞在DMEM高糖培養基中進行培養，內含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素/鏈霉素，置于含5% CO2的恒溫培養箱(37 ℃)中培養，根據細胞生長狀態，及時更換新鮮培養基，每隔2～3 d將細胞重新傳代1次。當細胞融合度達到80%～90%時，貼壁細胞用含0.25%胰酶和0.02% EDTA胰酶消化液進行消化處理，將細胞接種于6孔板和96孔板中，加入新鮮培養基，置于恒溫培養箱中培養。

1.3.2 不同濃度油酸處理BRL-3A細胞相對活力檢測 接種于96孔板內的BRL-3A細胞融合度達到70%～80%時，棄去培養液。PBS洗滌后，分別加入含有不同濃度油酸(0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 mmol·L-1)的無血清培養基；在5% CO2的恒溫培養箱(37 ℃)中培養24 h。隨后每孔細胞加入含0.5 mg·mL-1MTT的無胎牛血清培養液20 μL，繼續培養4 h 后，棄上清液，再加入150 μL DMSO 充分溶解，用酶標儀檢測各孔的吸光值，檢測其細胞相對活力。

1.3.3 不同濃度油酸處理BRL-3A細胞總脂滴面積、TG、AST和ALT指標檢測 將細胞按照合適密度接種于6孔板中，待細胞融合至80%時，棄去培養液，對細胞進行饑餓處理后，加入含有不同濃度油酸(0.03、0.06、0.12、0.24 mmol·L-1)的無血清培養基，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后，PBS沖洗3遍，10%福爾馬林將細胞固定30 min，室溫條件下，PBS沖洗3遍，用油紅O染液染色10 min，PBS緩沖液洗2次；倒置顯微鏡觀察細胞內脂滴染色情況，并進行統計分析。另外，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后收集細胞，棄上清進行TG含量、AST和ALT活性檢測。

1.4 不同濃度乙酸鈉處理BRL-3A細胞凋亡率指標檢測

將細胞培養于6孔板中，當細胞融合度達到80%～90%時，用低(2 mmol·L-1)、中(4 mmol·L-1)、高(8 mmol·L-1)濃度的乙酸鈉處理細胞24 h。收集細胞后加入200 μL的Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)原液重懸細胞，4 ℃避光孵育30 min，再加入10 μL碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min，采用美國BD FACS Calibur型流式細胞術檢測熒光強度，計算細胞凋亡率。

1.5 乙酸鈉對油酸誘導的BRL-3A細胞脂肪變性模型的影響

1.5.1 不同濃度乙酸鈉處理脂肪變性細胞模型胞內脂滴變化檢測 將細胞按照合適密度接種于6孔板中，待細胞融合至80%時，棄去培養液，對細胞進行饑餓處理后，將細胞分為油酸處理組(加入含有終濃度為0.12 mmol·L-1油酸的無血清培養基)，2 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組，4 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組和8 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組。在2 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組、4 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組和8 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組中，均為2 h后加入乙酸鈉。在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后, PBS沖洗3遍，10%福爾馬林將細胞固定30 min，室溫條件下，PBS沖洗3遍，用油紅O染液染色10 min，PBS緩沖液洗2次；倒置顯微鏡觀察細胞內脂滴染色情況，并進行統計分析。

1.5.2 不同濃度乙酸鈉處理脂肪變性細胞模型TG、AST和ALT指標檢測 接種于6孔板的細胞經過上述同樣處理后，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后，收集細胞，棄上清，進行TG含量、AST和ALT活性檢測，操作步驟按照說明書進行。提取細胞總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定并計算出蛋白濃度。

1.5.3 不同濃度乙酸鈉處理脂肪變性細胞模型AMPK通路蛋白檢測 Western blot檢測各處理細胞中P-AMPK/AMPK蛋白的表達變化，參照李林等[10]的方法進行操作。用ECL發光液進行Western blot圖像處理。用Image Lab 6.0分析條帶灰度值。

1.5.4 不同濃度乙酸鈉處理脂肪變性細胞模型脂代謝相關關鍵基因檢測 將收集的細胞采用TRIzol法直接提取總RNA，利用BioPhotometer測定樣品總RNA濃度，分析OD260 nm/OD280 nm值，判斷提取總RNA的純度，OD260 nm/OD280 nm需要為1.8～2.0。取1 μg總RNA進行反轉錄得到cDNA,詳細操作步驟參照說明書進行。

參照GenBank序列，用Primer Premier 5軟件自行設計，設計完成后送上海Sangon公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因及β-Actin引物序列

1.6 數據統計與分析

2 結 果

2.1 不同濃度油酸對BRL-3A細胞相對活力的影響

圖1所示，向細胞中添加不同濃度(0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 mmol·L-1)的油酸后，發現與對照組(0 mmol·L-1油酸)相比，0.48 mmol·L-1油酸對細胞有明顯的抑制作用，且差異顯著(P<0.05)。其他濃度的油酸處理細胞后與對照組相比，均無差異。結果提示：0.03～0.24 mmol·L-1的油酸對BRL-3A細胞無毒副作用。

2.2 不同濃度油酸對BRL-3A細胞總脂滴的影響

圖2所示，與對照組相比，0.12和0.24 mmol·L-1油酸處理后細胞總脂滴面積均極顯著上升(P<0.01)。

2.3 不同濃度油酸對BRL-3A細胞三酰甘油(TG)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的影響

表2所示，向細胞中添加不同濃度(0.03、0.06、0.12、0.24 mmol·L-1)的油酸。發現與對照組相比，0.06 mmol·L-1油酸處理后，TG含量顯著上升(P<0.05)；并且在0.12和0.24 mmol·L-1油酸處理后，TG含量極顯著上升(P<0.01)，提示造成了BRL-3A細胞的脂質蓄積。與對照組相比，0.12和0.24 mmol·L-1油酸處理后，BRL-3A細胞AST和ALT活性顯著上升(P<0.05)；其他濃度的油酸處理細胞后，AST和ALT活性均無顯著差異。

綜合以上細胞活力、細胞總脂滴面積、TG含量和AST、ALT活性測定結果，本試驗用不同濃度油酸誘導建立BRL-3A細胞體外脂肪變性模型的條件: 0.12 mmol·L-1油酸，培養時間為24 h。因此，后續選取0.12 mmol·L-1油酸進行誘導脂肪變性細胞模型處理試驗。

與對照組(0 mmol·L-1)相比，*. P<0.05Compared with control group(0 mmol·L-1)，*. P<0.05圖1 油酸對BRL-3A細胞相對活力分析Fig.1 Analysis of the relative activity of oleic acid on BRL-3A cells

與對照組相比，**表示差異極顯著(P<0.01)Compared with control group，**.P<0.01圖2 油酸處理BRL-3A細胞總脂滴面積結果分析Fig.2 Analysis of total lipid droplet area of BRL-3A cells treated with oleic acid

表2 油酸對BRL-3A細胞三酰甘油(TG)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的影響分析

2.4 不同濃度乙酸鈉對脂肪變性細胞模型總凋亡率的影響

分別用低(2 mmol·L-1)、中(4 mmol·L-1)、高(8 mmol·L-1)濃度的乙酸鈉作用BRL-3A細胞24 h后，通過流式細胞術檢測細胞凋亡率，發現不同濃度的乙酸鈉對細胞凋亡率均無影響(圖3)，證明乙酸鈉對細胞無毒害作用，可以進行下一步試驗。

圖3 乙酸鈉對BRL-3A細胞總凋亡率分析Fig.3 Analysis of sodium acetate on total apoptosis rate of BRL-3A cells

2.5 不同濃度乙酸鈉對脂肪變性細胞模型脂滴的影響

圖4所示，用0.12 mmol·L-1油酸分別和2、4、8 mmol·L-1的乙酸鈉共同孵育細胞24 h后，與油酸處理組相比，4 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組和8 mmol·L-1+油酸處理組細胞總脂滴面積和每平方毫米脂滴數極顯著下降(P<0.01)。提示，4和8 mmol·L-1的乙酸鈉可以顯著降低脂肪變性細胞模型的脂質堆積。

與油酸處理組相比，**. P<0.01Compared with oleic acid treatment group，**.P<0.01圖4 乙酸鈉對脂肪變性細胞模型脂滴影響分析Fig.4 Analysis of sodium acetate on lipid droplets in steatosis cell models

2.6 不同濃度乙酸鈉對脂肪變性細胞模型三酰甘油(TG)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的影響

表3所示，向細胞中添加不同濃度的乙酸鈉后，發現與油酸處理組相比，4 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理后，TG含量、AST活性和ALT活性均顯著下降(P<0.05)；并且在8 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理后，與對照組相比，TG含量極顯著下降(P<0.01)，ALT、AST活性均顯著下降(P<0.05)。

表3 乙酸鈉對脂肪變性細胞模型三酰甘油(TG)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)及丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的影響分析

2.7 不同濃度乙酸鈉對脂肪變性細胞模型AMPK信號蛋白的影響

進一步檢測細胞AMPK相關信號通路，結果發現(圖5)，與油酸處理組相比，4 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組P-AMPK表達水平顯著上調(P<0.05)；8 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組P-AMPK表達水平極顯著上調(P<0.01)。提示，乙酸鈉激活了脂肪變性細胞模型的AMPK信號通路。

與油酸處理組相比，*.P<0.05, **.P<0.01Compared with oleic acid treatment group, *.P<0.05, **.P<0.01圖5 脂肪變性細胞模型P-AMPK蛋白表達水平變化Fig.5 The P-AMPK protein expression level in steatosis cell models

2.8 不同濃度乙酸鈉對脂肪變性細胞模型脂合成代謝關鍵基因的影響

通過檢測與AMPK信號通路下游相關的關鍵脂合成代謝基因，圖6A發現,與油酸處理組相比，4 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組和8 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組ACC mRNA表達含量均顯著下降(P<0.05)；圖6B發現,與油酸處理組相比，8 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組FAS mRNA表達含量顯著下降(P<0.05)，而其他乙酸鈉+油酸處理組與油酸處理組相比，均無顯著差異；圖6C發現與油酸處理組相比，2、4、8 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組SCD-1 mRNA表達含量均顯著下降(P<0.05)。

與油酸處理組相比，*.P<0.05Compared with oleic acid treatment group，*.P<0.05圖6 脂肪變性細胞模型脂合成代謝基因表達Fig.6 The expression levels of lipid anabolism genes in steatosis cell models

2.9 不同濃度乙酸鈉對脂肪變性細胞模型脂分解代謝關鍵基因的影響

通過檢測與AMPK信號通路下游相關的關鍵脂分解代謝基因，圖7A發現與油酸處理組相比，4 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組和8 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組CPT-1 mRNA表達量均顯著上升(P<0.05)；圖7B發現，與油酸處理組相比，8 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組CPT-2 mRNA表達量顯著上升(P<0.05)；而圖7C發現，2、4、8 mmol·L-1乙酸鈉+油酸處理組ACO mRNA表達量，與油酸處理組相比，均無顯著差異。

與油酸處理組相比，*.P<0.05Compared with oleic acid treatment group，*.P<0.05圖7 脂肪變性細胞模型脂分解代謝基因表達Fig.7 The expression levels of lipid catabolism genes in steatosis cell models

3 討 論

3.1 油酸誘導脂肪變性細胞模型的建立

脂肪肝的發生與動物肝脂質代謝的異常有關。NAFLD是一種以肝細胞內脂質過度積聚為特征的疾病。如果動物沒有得到及時治療，NAFLD就可能從單純性肝脂肪變性發展為非酒精性脂肪性肝炎，或者發展為肝纖維化、肝硬化甚至肝細胞癌。動物超重、胰島素抵抗、圈養、飲食模式改變、遺傳因素以及腸道屏障功能的紊亂都有可能導致NAFLD[11]。

目前，脂肪肝動物模型的構建通常通過高脂、高糖、四環素等毒物或藥物構建[12-13]；而體外脂肪變性模型的構建通常采用油酸、脂肪酸、棕櫚酸等處理方法[14-15]。本試驗首先用不同濃度的油酸誘導BRL-3A細胞，經細胞活力測定分析發現，向細胞中添加(0.03、0.06、0.12、0.24、0.48)mmol·L-1油酸后，與對照組相比，只有0.48 mmol·L-1油酸對細胞有明顯的抑制作用，證明0.48 mmol·L-1油酸對BRL-3A細胞毒性較大，并且通過顯微鏡觀察發現細胞出現受損死亡等情況，而其他濃度的油酸對BRL-3A細胞無毒副作用。通過油紅O染色進一步檢測細胞總脂滴面積，發現與對照組相比，0.12和0.24 mmol·L-1油酸處理后細胞總脂滴面積極顯著上升。轉氨酶是肝損傷的主要標志物，主要由AST和ALT組成。其中，AST主要分布于心肌、肝、腎等組織，而ALT則主要分布于肝組織中[16]。醫學上當超過5%脂肪堆積在肝中時，就稱為脂肪肝。本試驗油酸濃度為0.06 mmol·L-1時，TG含量就增加了一倍；并且在0.12和0.24 mmol·L-1油酸處理后，TG含量極顯著上升，同時AST和ALT活性皆升高，提示肝細胞出現損傷。所以結合上述細胞總脂滴面積結果，當油酸濃度為0.12 mmol·L-1，刺激時間為24 h，即可成功構建脂肪變性細胞模型。

短鏈脂肪酸是腸道菌群膳食纖維的主要代謝產物。乙酸、丙酸和丁酸是人類腸道中最豐富的短鏈脂肪酸[17]。短鏈脂肪酸不僅是代謝底物，也是調節肝代謝的信號分子[18]。乙酸是動物機體內最主要的短鏈脂肪酸之一，占體循環內短鏈脂肪酸含量的一半以上。乙酸除了能作為能量底物和碳源參與機體內代謝活動外，還對機體脂肪代謝、食欲調節和胰島素抵抗等方面具有重要作用[19-21]。白鴿等[22]研究發現，向牛肝細胞中添加乙酸鈉，會加速肝脂肪酸的氧化。本試驗通過流式細胞術檢測細胞凋亡率，發現不同濃度的乙酸鈉對正常的BRL-3A細胞凋亡率均無影響，證明乙酸鈉對細胞無毒副作用，可用于后續研究。進一步用4和8 mmol·L-1乙酸鈉處理脂肪變性細胞模型后，均使細胞總脂滴面積、每平方毫米脂滴數、TG含量下降，AST和ALT活性皆下調，這與前人的研究結果一致。提示乙酸鈉可以顯著降低脂肪變性細胞模型的脂質堆積，緩解肝細胞損傷，具體機制有待進一步研究證實。

肝是調節脂質代謝、維持脂質穩態的重要器官。AMPK是肝細胞中能量的“傳感器”和“調節器”。AMPK可調控脂質代謝酶的表達來調節肝脂質代謝。因此，AMPK信號通路在肝脂質代謝中起中心作用[23]。研究表明，乙酸可激活AMPK，AMPK進而上調肝中脂質氧化基因的表達，減少脂肪堆積[9,24-25]。小鼠肝特異性AMPK缺失導致血漿TG含量和肝脂肪生成增加[26]。AMPK還可以通過調控骨骼肌中葡萄糖攝取和游離脂肪酸氧化，抑制肝中的糖異生、糖酵解、脂肪生成和膽固醇形成[27]。本試驗發現，用不同濃度乙酸鈉處理脂肪變性細胞模型后，4和8 mmol·L-1乙酸鈉均可激活AMPK信號通路關鍵蛋白。

TG是細胞內和血漿中脂肪酸儲存和運輸的主要形式。肝是脂肪酸代謝的中心器官，肝細胞通過從血漿中攝取和從頭生物合成的方式在肝中積累脂肪酸[28]。脂肪酸的從頭合成主要受相關關鍵酶所調控，其中，乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)可以將乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A[29]；脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，FAS)是催化脂肪酸從頭生成的最后一步[30]；SCD-1是單不飽和脂肪酸合成的關鍵調控因子[31]。而脂肪酸的分解代謝受CPT-1、CPT-2等酶的調控，主要是將脂肪酸轉運到線粒體進行氧化分解，這是脂肪酸在β-氧化過程中的限速步驟[32]。本研究發現，用不同濃度的乙酸鈉處理脂肪變性細胞模型后，4和8 mmol·L-1乙酸鈉均會導致細胞ACC mRNA表達量顯著下降；8 mmol·L-1乙酸鈉會導致FAS mRNA表達量顯著下降；而2、4、8 mmol·L-1乙酸鈉均可使SCD-1 mRNA表達量顯著下降。4和8 mmol·L-1乙酸鈉會導致與脂肪酸分解代謝的相關酶CPT-1 mRNA表達量顯著上調；而8 mmol·L-1乙酸鈉會導致CPT-2 mRNA表達量顯著上調。提示，乙酸鈉主要通過CPT-1促進了脂肪變性細胞模型胞液中脂肪酸轉運到線粒體進行氧化分解，并且通過SCD-1進一步抑制了飽和脂肪酸催化合成單不飽和脂肪酸，進而降低了細胞中脂質的含量。以上結果表明，乙酸鈉可通過AMPK信號通路調控脂肪變性細胞模型脂代謝關鍵酶的活性，促使脂肪酸的從頭合成途徑被抑制，激活脂肪酸的分解途徑，進而減少BRL-3A細胞TG的合成。

4 結 論

油酸誘導的脂肪變性細胞模型，會造成肝細胞受到一定程度的損傷。而用不同濃度乙酸鈉會通過AMPK信號通路促進脂肪酸的分解代謝，進而減少TG的合成，同時可以抑制肝細胞損傷，從而緩解脂肪變性所帶來的負面影響，為今后NAFLD的治療提供了新的理論依據和切入點。