P7C3-A20對創(chuàng)傷性腦損傷的PC12細胞凋亡和氧化的影響

楊芷清，張浩權(quán)，冼潤浠，李欣然，2*

(1.佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院，佛山 528225； 2.佛山科學技術(shù)學院附屬教學動物醫(yī)院，佛山 528225)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)對動物的健康問題危害嚴重。TBI主要是由機械外力引起的，造成的主要原因：打架、撞擊、墜落等。TBI所造成的原發(fā)性損傷往往不可逆轉(zhuǎn)，會直接導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，只能通過干預(yù)TBI造成的繼發(fā)性損傷來治療，但TBI的病理機制較為復(fù)雜，損傷過程包括線粒體損傷導(dǎo)致的細胞凋亡和氧化應(yīng)激，細胞能量產(chǎn)生降低和彌漫性軸索損傷等[1-2]。TBI具有高致殘率、高死亡率、高治療費的特點，它的發(fā)生會降低患畜的生活質(zhì)量，甚至會導(dǎo)致嚴重的殘疾或死亡，且預(yù)后不良[3]。雖然人們已經(jīng)意識到TBI的危害，但目前對治療TBI的特效藥物研究仍處于起步階段，缺乏有效的治療藥物去治療由TBI引起的各種損傷，如不及時治療，會造成不可逆的損傷，是一項迫切需要解決的公共衛(wèi)生和醫(yī)療問題。所以需要繼續(xù)探索對TBI有修復(fù)作用的藥物，以進一步改善TBI的預(yù)后。3, 6-二溴-beta-氟-N-(3-甲氧基苯基)-9H-咔唑-9-丙胺(P7C3-A20)是一種穩(wěn)定細胞能量水平的化合物，可以通過血腦屏障，具有治療TBI的潛力[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，P7C3-A20能對中風大鼠的腦細胞提供保護作用，在抑制成熟神經(jīng)細胞死亡的同時，也可以增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的通量，并且接受P7C3-A20治療的大鼠肢體性能和認知功能得到了改善[6-7]。即使大鼠在中風后延遲6 h腹腔注射P7C3-A20，依然具有減輕神經(jīng)變性和促進慢性功能恢復(fù)的治療效果[8]。研究也證實P7C3-A20的治療可以恢復(fù)正常的血腦屏障內(nèi)皮細胞長度，增加腦毛細血管周細胞密度，增加血腦屏障緊密連接蛋白的表達，減少腦內(nèi)免疫球蛋白的浸潤，阻止慢性神經(jīng)變性和恢復(fù)認知[4]。雖然P7C3-A20已被證實在缺血性中風和神經(jīng)退行性疾病等各種疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但是在大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細胞株(PC12細胞)TBI模型中，P7C3-A20與神經(jīng)元凋亡和氧化應(yīng)激的關(guān)系尚不清楚。本研究旨在通過CCK8試劑盒測定細胞活力，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡、活性氧含量，熒光定量PCR檢測mRNA等方法探明P7C3-A20在PC12細胞TBI模型中所起的作用，為臨床合理用藥提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

3,6-二溴-beta-氟-N-(3-甲氧基苯基)-9H-咔唑-9-丙胺(P7C3-A20)，分子式為C22H19Br2FN2O，購自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、細胞活性氧(ROS)檢測試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；LightCycler 480 SYBR Green I Master購自Roche公司。

1.2 主要儀器

Biotek 800TS吸收光酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；ECHO revolve FL正置倒置一體熒光顯微鏡(北京深藍云生物科技有限公司)；Roche LightCycler480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.3 試驗細胞

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細胞株(PC12細胞)，由東北農(nóng)業(yè)大學臨床教研室高利教授課題組饋贈。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設(shè)計 將PC12細胞分為6組，分別為對照組(A組)、模型組(B組)和造模加藥物治療組，其中藥物濃度分為0.03、0.3、和3 μmol·L-13組(C～E組)和藥物空白組(F組)。A組不造模，在添加含100 mL·L-1血清、10 mL·L-1雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞，并把細胞放置于37 ℃，50 mL·L-1CO2的培養(yǎng)箱中。B～E組模型通過使用10 μL槍頭劃出橫豎相間4 mm的直線來制備[9]。B組造模后，后續(xù)處理與對照組相同。C～E組造模后使用不同濃度的P7C3-A20藥物溶液對細胞進行治療。F組不造模，只在對照組的基礎(chǔ)上添加3 μmol·L-1的P7C3-A20藥物溶液。

1.4.2 酶標儀檢測細胞活力 在96孔板中，每孔接種100 μL細胞懸液，細胞密度為1×105·mL-1，待細胞貼壁完全后處理細胞，各組培養(yǎng)24 h后加入CCK8液，在培養(yǎng)箱避光孵育1 h，然后使用酶標儀測定450 nm處的吸光度。采用說明書中“細胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[ A(0加藥)-A(空白)] ×100”公式對細胞活力進行計算。

1.4.3 熒光顯微鏡觀察細胞凋亡、活性氧情況 在24孔板中，每孔接種500 μL細胞懸液，細胞密度為2×105·mL-1，待細胞貼壁完全后處理細胞，然后按說明使用Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒與細胞活性氧(ROS)檢測試劑盒對細胞進行染色，最后使用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡與活性氧的情況。

1.4.4 熒光定量PCR檢測Caspase-3、Bcl-2、HO-1、NQO1和GCLCmRNA相對表達量 應(yīng)用SYBR Green熒光定量PCR檢測半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、血紅素氧合酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)在PC12細胞中的mRNA相對表達量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計與合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系為LightCycler 480 SYBR Green I Master 10 μL、Double Distilled Water 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，53 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，45個循環(huán)；95 ℃ 5 s；65 ℃ 1 min；每間隔5 s上升0.5 ℃至97 ℃。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算Caspase-3、Bcl-2、HO-1、NQO1、GCLC的mRNA相對表達量。

1.5 統(tǒng)計分析

表1 熒光定量PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 P7C3-A20對細胞活力的影響

PC12細胞活力結(jié)果如圖1所示。數(shù)據(jù)顯示模型組對比對照組，細胞活力極顯著下降(P<0.01)。0.03 μmol·L-1藥物治療組對比模型組，細胞活力顯著上升(P<0.05)。0.3 μmol·L-1藥物治療組對比模型組，細胞活力極顯著上升(P<0.01)。

A. 對照組；B. 模型組；C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；E. 3 μmol·L-1 P7C3-A20藥物治療組。與A組比較，**.P<0.01；與B組比較，#.P<0.05，##.P<0.01A. Control group; B. Model group; C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; E. 3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group. Compared with group A, **. P<0.01. Compared with group B, #. P<0.05, ##.P<0.01圖1 細胞活力Fig.1 Cell viability

2.2 P7C3-A20對PC12細胞凋亡的影響

PC12細胞凋亡情況如圖2和圖3所示，圖3的結(jié)果為各試驗組凋亡細胞比例與對照組凋亡細胞比例的比值。數(shù)據(jù)顯示，相對于對照組，模型組早晚期凋亡細胞比例均極顯著增加(P<0.01)。0.03 μmol·L-1藥物治療組對比模型組早期凋亡細胞比例顯著減少(P<0.05)，晚期凋亡細胞比例極顯著減少(P<0.01)。0.3 μmol·L-1和3 μmol·L-1藥物治療組對比模型組早晚期凋亡細胞比例均極顯著減少(P<0.01)。

A.對照組；B.模型組；C.0.03 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；D.0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；E. 3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組A. Control group; B. Model group; C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; E. 3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group圖2 PC12細胞凋亡檢測(Annexin V-FITC/PI染色，標尺=100 μm)Fig.2 PC12 cell apoptosis detection (Annexin V-FITC/PI stain, Bar=100 μm)

A. 對照組；B. 模型組；C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；E. 3 μmol·L-1 P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組。與A組比較，**.P<0.01；與B組比較，#.P<0.05，##.P<0.01A. Control group; B. Model group; C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; E. 3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group. Compared with group A, **. P<0.01. Compared with group B, #. P<0.05, ##.P<0.01圖3 凋亡細胞比例Fig.3 Proportion of apoptotic cells

2.3 P7C3-A20對PC12細胞活性氧的影響

PC12細胞活性氧情況如圖4和圖5所示，圖5的結(jié)果為各試驗組活性氧細胞比例與對照組活性氧細胞比例的比值。數(shù)據(jù)顯示，相對于對照組，模型組活性氧細胞比例極顯著增加(P<0.01)。0.03 μmol·L-1和3 μmol·L-1藥物治療組對比模型組活性氧細胞比例均顯著減少(P<0.05)。0.3 μmol·L-1藥物治療組對比模型組活性氧細胞比例極顯著減少(P<0.01)。

A.對照組；B.模型組；C.0.03 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；D.0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；E. 3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組A. Control group; B. Model group; C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; E. 3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group圖4 PC12細胞活性氧檢測(DCFHDA染色，標尺=100 μm)Fig.4 PC12 cell ROS detection (DCFHDA stain, Bar=100 μm)

A. 對照組；B. 模型組；C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；E. 3 μmol·L-1 P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組。與A組比較，**.P<0.01；與B組比較，#.P<0.05，##.P<0.01A. Control group; B. Model group; C. 0.03 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; E. 3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group. Compared with group A, **. P<0.01. Compared with group B, #. P<0.05, ##.P<0.01圖5 活性氧細胞比例Fig.5 Proportion of reactive oxygen cells

2.4 P7C3-A20對PC12細胞中Caspase-3、Bcl-2、HO-1、NQO1和GCLC mRNA表達的影響

Caspase-3和Bcl-2 mRNA熒光定量PCR檢測結(jié)果如圖6所示，0.3 μmol·L-1藥物治療組對比模型組Caspase-3 mRNA表達量極顯著下降(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達量顯著上升(P<0.05)。HO-1、NQO1和GCLCmRNA熒光定量PCR檢測結(jié)果如圖7所示，0.3 μmol·L-1藥物治療組對比模型組NQO1、HO-1和GCLCmRNA表達量顯著上升(P<0.05)。

A. 對照組；B. 模型組；D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組。與A組比較，**.P<0.01；與B組比較，#.P<0.05，##.P<0.01A. Control group; B. Model group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group. Compared with group A, **. P<0.01. Compared with group B, #. P<0.05, ##.P<0.01圖6 PC12細胞中Caspase-3、Bcl-2 mRNA的表達量Fig.6 The relative expression of Caspase-3, Bcl-2 mRNA in PC12 cells

A. 對照組；B. 模型組；D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20藥物治療組；F. 藥物空白組。與A組比較，*.P<0.05，**.P<0.01；與B組比較，#.P<0.05A. Control group; B. Model group; D. 0.3 μmol·L-1P7C3-A20 drug treatment group; F. Drug blank group. Compared with group A, *.P<0.05，**. P<0.01. Compared with group B, #. P<0.05圖7 PC12細胞中HO-1、NQO1、GCLC mRNA的表達量Fig.7 The relative expression of HO-1, NQO1, GCLC mRNA in PC12 cells

3 討 論

3.1 PC12細胞造模模擬TBI的可行性分析

TBI對動物危害嚴重，任何對頭部的強烈撞擊都可能導(dǎo)致TBI的發(fā)生，隨后會導(dǎo)致運動、感覺和認知等功能障礙，另外還促進氧自由基增多和細胞凋亡等病理過程，且這種損害常常持續(xù)很久，甚至持續(xù)終生[10-11]。動物在體試驗昂貴且費力，細胞體外模型具有易于構(gòu)建，費時短，花費低，干擾因素少，試驗條件可控性強等優(yōu)點[12]。PC12細胞系是神經(jīng)科學研究中最常用的細胞之一，源于大鼠嗜鉻細胞瘤[13]。細胞體外TBI模型通過機械橫斷體外細胞，已被許多研究者認可并使用[9,12,14-15]。本試驗通過使用10 μL移液槍頭劃斷神經(jīng)元神經(jīng)突來制備細胞體外TBI模型，能夠模擬神經(jīng)元的軸索損傷，是一種操作簡單，效果顯著的體外模型，用于模擬體外TBI后的各種腦組織病變[9]。P7C3-A20能增強正常哺乳動物細胞中NAD補救途徑的通量，阻止細胞死亡[6]。NAD在調(diào)節(jié)線粒體代謝的基本底物方面起重要作用，也是ATP產(chǎn)生的主要底物，對細胞生長、分化，能量代謝和細胞保護方面發(fā)揮重要作用。TBI模型中，對PC12細胞使用P7C3-A20能提高細胞活力。

3.2 P7C3-A20對創(chuàng)傷性腦損傷后的PC12細胞具有抗凋亡的作用

細胞凋亡指的是特定蛋白相互作用，程序化傳遞死亡誘導(dǎo)信號，從而進行細胞分解的過程[16]。凋亡細胞以核小體結(jié)構(gòu)、脫落受體、抗炎代謝物或者包裝在凋亡細胞外囊泡(ApoEVs)中的分子形式釋放信使[17]。在此試驗中，Annexin V-FITC能在Ca2+環(huán)境下與磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合，早期凋亡細胞PS會從細胞膜內(nèi)側(cè)外翻，會被Annexin V-FITC染料染成綠色。PI不能透過完整細胞膜，但當細胞膜破損后，PI則能滲透進去，故晚期凋亡細胞會被Annexin V-FITC與PI同時染成綠色與紅色。半胱氨酸蛋白酶(caspase)可以啟動細胞凋亡，其家族成員Caspase-3是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)關(guān)鍵的因子，細胞凋亡信號出現(xiàn)時，會導(dǎo)致Caspase-3裂解并被激活，而活化后的Caspase-3又會進一步放大蛋白酶級聯(lián)切割效應(yīng)，導(dǎo)致細胞最終走向死亡，Caspase-3一旦被激活，細胞凋亡則不可避免[10,18]。Caspase-3是重要的凋亡蛋白酶，其表達量可直接反映細胞凋亡的程度[18]。Bcl-2是典型的抗凋亡蛋白，可以通過形成異源二聚體來抑制凋亡，還可以通過抗氧化作用來提高細胞存活率[16]。TBI后使用P7C3-A20治療，凋亡面積減少，Caspase-3 mRNA表達量下降，Bcl-2 mRNA表達量上升，表明P7C3-A20可以減少TBI后的神經(jīng)元凋亡，具有抗凋亡的功能。

3.3 P7C3-A20對創(chuàng)傷性腦損傷后的PC12細胞具有抗氧化應(yīng)激的作用

ROS誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化在細胞死亡中起重要作用，由于多不飽和脂肪酸含量較高，細胞膜和細胞器膜很容易受到ROS損傷，甚至會導(dǎo)致細胞凋亡[19]。ROS包括過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、超氧陰離子(·O2-)、羥基自由基(·OH)、過氧化自由基(ROO·)、過氧羥自由基(HOO·)和單線態(tài)氧(1O2)等，它們會被DCFHDA熒光探針標記成綠色。ROS的過度產(chǎn)生會攻擊生物膜，對細胞成分產(chǎn)生不利的影響，增強各種致病機制，引起氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激會引起大腦神經(jīng)損傷，誘導(dǎo)不同類型的細胞死亡。HO-1、NQO1和GCLC是Nrf2下游的抗氧化基因，上調(diào)HO-1、NQO1和GCLC基因的表達可以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用[20-22]。HO-1在其啟動子區(qū)域有一個抗氧化反應(yīng)元件，HO-1直接影響機體的抗氧化平衡，并具有抗凋亡的作用[23]。NQO1能以NAD (P) H為受體，將醌類物質(zhì)通過雙電子還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為低毒性的氫醌類物質(zhì)，從而避免細胞氧化損傷[24-25]。GCLC是抗氧化蛋白酶，能提高抗氧化應(yīng)激的能力[20]。TBI后使用P7C3-A20治療，活性氧面積減少，HO-1、NQO1和GCLCmRNA的表達量上升，說明PC12細胞在TBI后使用P7C3-A20會使氧化應(yīng)激減少。

4 結(jié) 論

P7C3-A20對創(chuàng)傷性腦損傷后的PC12細胞有抗凋亡、減輕氧化應(yīng)激的修復(fù)作用。