非洲豬瘟病毒多基因家族MGF360-13L基因功能的初步研究

陳達(dá)年，馬旭升，代軍飛，汪 洋，李 茜，白 衡，毛甜甜，劉永生，丁 龍，陳昊翰，陳思言，饒宇飛，賈 寧*，張 杰,*，鄭海學(xué)，劉湘濤

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 蘭州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)與生物安全學(xué)院 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000；3.河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島 066004；4.深圳真瑞生物科技有限公司，深圳 518000)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASF virus, ASFV)感染引起家豬和野豬的一種急性、出血性的烈性傳染病[1]。動(dòng)物感染不同的ASFV毒株產(chǎn)生不同臨床癥狀，從亞臨床型到高度致死型[2]。2018年，我國(guó)首次爆發(fā)ASF疫情之后，該病在我國(guó)迅速蔓延，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和國(guó)內(nèi)動(dòng)物食品安全造成了嚴(yán)重威脅[3]。ASFV的基因組龐大，且對(duì)其病毒基因的功能注釋仍不完全清楚，是導(dǎo)致目前沒(méi)有獲得有效疫苗的重要原因之一。目前，該病仍在非洲、歐洲和亞洲持續(xù)傳播，防控形勢(shì)至今仍異常嚴(yán)峻[4]。因此，對(duì)于ASFV的基因進(jìn)行功能注釋顯得尤為重要。

ASFV是一種大型、高度結(jié)構(gòu)化的包膜DNA病毒，具有雙鏈DNA基因組(180～190 kb)，編碼至少160個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)，包括結(jié)構(gòu)蛋白、免疫逃避蛋白、病毒復(fù)制相關(guān)蛋白、多基因家族蛋白和許多功能未知蛋白[5]。ASFV基因組中大約30%的基因具有多個(gè)拷貝，稱(chēng)為多基因家族(multigene families，MGF)，包括 MGF100、MGF110、MGF300、MGF360和MGF505/530，由于MGF基因插入和刪除，ASFV基因組長(zhǎng)度在不同毒株間存在差異[6]。不同ASFV毒株的基因組含有數(shù)目不同的MGF，這些基因與ASFV的嗜性、天然免疫逃逸及病毒毒力相關(guān)[7]。有研究報(bào)道，在強(qiáng)毒力ASFV Georgia 2007/1(ASFV-G)中特異性地刪除包括MGF360-13L在內(nèi)的6個(gè)MGF基因后免疫家豬，能夠有效提高免疫豬受強(qiáng)毒株ASFV-G感染的存活率[8]，這提示了MGF360-13L在ASFV致病過(guò)程中可能具有重要功能。目前，已有研究證明MGF360-13L能夠通過(guò)cGAS-STING信號(hào)通路抑制宿主Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[9]，但該研究?jī)H通過(guò)外源表達(dá)的方法研究了蛋白功能。在實(shí)際情況中，ASFV編碼多種蛋白，其中許多蛋白間存在相互作用，因此，利用單基因缺失株研究MGF360-13L基因功能具有重要意義。

炎癥反應(yīng)是天然免疫的重要組成部分，與病毒感染后的發(fā)病進(jìn)程和致病力有關(guān)[10]。在豬體內(nèi)，ASFV主要在血液中的單核細(xì)胞和組織中的巨噬細(xì)胞中復(fù)制，不同ASFV感染巨噬細(xì)胞后，促炎性細(xì)胞因子的分泌活化能力也存在差異[11]。而目前關(guān)于 ASFV 調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)相關(guān)研究仍然不完全清楚，因此對(duì)于ASFV調(diào)控炎癥反應(yīng)的研究勢(shì)在必行。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與主要試劑

非洲豬瘟基因II型野生毒株ASFV CN/GS/2018 由蘭州獸醫(yī)研究所P3實(shí)驗(yàn)室分離并保存；豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)和豬骨髓巨噬細(xì)胞(porcine bone marrow macrophages，BMDM)取自40日齡仔豬；pAVX1真核表達(dá)載體、大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞、293T人源上皮細(xì)胞和IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDHqPCR檢測(cè)引物[12]由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫與新發(fā)流行病學(xué)團(tuán)隊(duì)保存；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自 Gibco 公司；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自欣博盛公司；質(zhì)粒大提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自Promega生物科技有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購(gòu)于中杉金橋公司；一步法TB Green?RT-PCR定量檢測(cè)試劑盒、PrimeSTAR?HS 高保真PCR酶購(gòu)自TaKaRa公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit重組酶購(gòu)自南京諾唯贊生物公司。

1.2 ASFV MGF360-13L 生物信息學(xué)分析

以ASFV CN/GS/2018全基因組序列中MGF360-13L基因?yàn)榉治鰧?duì)象，使用 ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析MGF360-13L蛋白的親疏水性；使用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè) MGF360-13L蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽；利用PredictProtein在線工具(http://www.predictprotein.org/)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)的同源建模方法構(gòu)建蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。通過(guò)EBI(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對(duì)基因II型ASFV的MGF360-13L基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，利用MEGA7.0.26 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 ASFV MGF360-13L基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

根據(jù)ASFV CN/GS/2018毒株序列設(shè)計(jì)含有真核表達(dá)載體pVAX1同源臂的MGF360-13L全基因擴(kuò)增引物 F1/R1(表1)，并在目的基因N端添加Flag標(biāo)簽序列；以提取的ASFV CN/GS/2018基因組為模板，使用PrimeSTAR?HS 高保真PCR酶擴(kuò)增MGF360-13L基因片段，擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸70 s，34次循環(huán)；72 ℃總延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收。使用ClonExpress II One Step Cloning Kit連接酶將載體與目的片段進(jìn)行連接，37 ℃連接30 min，構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒pVAX1-MGF360-13L送至蘭州天啟基因生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)驗(yàn)證。

1.4 重組轉(zhuǎn)移載體p72mCherry MGF360-13L構(gòu)建

單基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L由親本毒株ASFV CN/GS/2018與重組轉(zhuǎn)移載體p72mCherry MGF360-13L同源重組生成。p72mCherry MGF360-13L重組轉(zhuǎn)移載體包含MGF360-13L基因上、下游各約1 000 bp的同源臂序列(對(duì)應(yīng)病毒基因組位置分別為29 584～20 594 bp和31 657～32 657 bp)，上、下游同源臂序列間為p72啟動(dòng)子和mCherry基因。分別設(shè)計(jì)上游同源臂擴(kuò)增引物360-13L-L-F2/R2、下游同源臂擴(kuò)增引物360-13L-R-F3/R3和p72mCherry熒光報(bào)告盒擴(kuò)增引物360-13L-mCherry-F4/R4(表1)，擴(kuò)增同源臂和p72mCherry熒光基因，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit重組酶將上述3個(gè)片段與線性化載體 pUC19進(jìn)行連接，將構(gòu)建完成的p72mCherry-MGF360-13L進(jìn)行單酶切鑒定后測(cè)序驗(yàn)證。

表1 本研究用引物

1.5 ASFV-ΔMGF360-13L缺失毒制備

將測(cè)序正確的p72mCherry MGF360-13L轉(zhuǎn)染BMDM細(xì)胞，1 h后感染ASFV CN/GS/2018毒株，使ASFV CN/GS/2018與p72mCherry MGF360-13L在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組，生成重組病毒ASFV-ΔMGF360-13L，感染48 h后通過(guò)觀察mCherry熒光，挑取具有mCherry熒光的BMDM，通過(guò)連續(xù)14輪極限稀釋純化得到重組ASFV-ΔMGF360-13L。為檢測(cè)制備缺失毒株的純度，根據(jù)MGF360-13L基因設(shè)計(jì)引物 360-13L-F5/R5(表1)；分別以提取的ASFV CN/GS/2018和ASFV-ΔMGF360-13L基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，62 ℃退火15 s，72 ℃延伸70 s，34次循環(huán)；72 ℃總延伸5 min。將提取的ASFV-ΔMGF360-13L基因組送基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 ASFV-ΔMGF360-13L體外生長(zhǎng)曲線測(cè)定

比較ASFV-ΔMGF360-13L與ASFV CN/GS/2018的體外生長(zhǎng)趨勢(shì)。將PAMs細(xì)胞鋪于96孔板中過(guò)夜培養(yǎng)形成單層細(xì)胞，并以MOI=0.01的ASFV-ΔMGF360-13L與ASFV CN/GS/2018感染細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，吸附1 h后去除接種物，用PBS沖洗3次，加入1.5 mL培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2、24、48、72和96 h，在感染后不同時(shí)間點(diǎn)收取樣品，凍融后，在PAMs細(xì)胞上進(jìn)行病毒滴定，通過(guò)血細(xì)胞吸附試驗(yàn)(HAD)計(jì)算病毒滴度。

1.7 ASFV-ΔMGF360-13L感染BMDM細(xì)胞后炎性因子的檢測(cè)

為了探究ASFV-ΔMGF360-13L與ASFV CN/GS/2018 在感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平是否相同；將BMDM細(xì)胞鋪于6孔板中過(guò)夜培養(yǎng)形成單層細(xì)胞，并以MOI=1分別感染ASFV-ΔMGF360-13L與ASFV CN/GS/2018，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中各分別孵育4、8、12、24、48 h后收取細(xì)胞樣品；用TRIzol總RNA提取試劑提取總RNA，使用一步法TB Green?RT-PCR定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子的mRNA水平。熒光定量PCR反應(yīng)條件：42 ℃ 反轉(zhuǎn)錄5 min、95 ℃ 預(yù)變性10 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s，40次循環(huán)；使用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清樣品中分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α含量；并用qPCR檢測(cè)病毒基因組拷貝數(shù)[13]。

1.8 生物安全

涉及ASFV病原的操作及樣品的制備在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所P3實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，試驗(yàn)中所產(chǎn)生的廢棄物均經(jīng)過(guò)滅菌殺毒后無(wú)害化處理。

2 結(jié) 果

2.1 MGF360-13L基因生物信息學(xué)分析

利用ProtScale軟件對(duì)MGF360-13L基因做親水性分析，縱坐標(biāo)負(fù)值表示親水區(qū)，可見(jiàn)組成MGF360-13L 蛋白的氨基酸多集中在正值，整體表現(xiàn)為疏水性(圖1A)；TMHMM Server v.2.0 軟件預(yù)測(cè)表明，MGF360-13L 蛋白不存在跨膜區(qū)(圖1B)；使用SignalP-5.0 Server軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MGF360-13L 蛋白S值為0.110 1(S>0.5，則判斷為分泌蛋白并且有信號(hào)肽)，說(shuō)明該蛋白不是分泌蛋白且不存在信號(hào)肽(圖1C)；預(yù)測(cè)MGF360-13L蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲分別占52.12%、0.00%、5.38%和27.20%，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲比例高則有助于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；其三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1D，有α-螺旋結(jié)構(gòu)富集域,以β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲連接形成其特定結(jié)構(gòu)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。通過(guò)EBI對(duì)比不同ASFV 的MGF360-13L蛋白氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在不同基因II型病毒分離株中MGF360-13L蛋白序列相對(duì)保守，從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知我國(guó)流行的ASFV基因II型毒株與ASFV-G關(guān)系密切(圖2)。

A.蛋白親疏水性分析；B.跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；C.信號(hào)肽預(yù)測(cè)；D.三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A. Hydrophilic analysis; B. Prediction of transmembrane region; C. Signal peptide prediction; D. Tertiary structure prediction圖1 MGF360-13L生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of MGF360-13L

圖2 ASFV MGF360-13L 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of ASFV MGF360-13L gene

2.2 MGF360-13L基因外源表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)驗(yàn)證

使用ASFV CN/GS/2018基因組DNA為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增目的片段MGF360-13L，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)與預(yù)期目的片段大小相同(圖3A)。將連接后的載體進(jìn)行單酶切(HindⅢ)驗(yàn)證，條帶大小與預(yù)期條帶大小相一致，同時(shí)送測(cè)序驗(yàn)證(圖3B)；測(cè)序正確后提取表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后利用Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，在41 ku處出現(xiàn)特異性條帶，ASFV MGF360-13L基因外源表達(dá)成功(圖4)。

2.3 ASFV-ΔMGF360-13L缺失毒株構(gòu)建、純化以及鑒定

為進(jìn)一步研究MGF360-13L基因在病毒復(fù)制過(guò)程中的功能，使用同源重組方法構(gòu)建基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L(圖5)。首先擴(kuò)增同源臂及熒光基因片段(圖6A)，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體p72mCherry-MGF360-13L，酶切驗(yàn)證(HindⅢ)符合預(yù)期大小后質(zhì)粒測(cè)序(圖6B)。將測(cè)序正確的重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染BMDM細(xì)胞，1 h后感染ASFV CN/GS/2018。通過(guò)觀察熒光判斷病毒重組效率及純化效率(圖7)，連續(xù)純化多代，其間收集細(xì)胞病毒提取基因組DNA，利用PCR鑒定病毒純度，最終經(jīng)過(guò)14輪純化獲得單純的MGF360-13L單基因缺失毒株(圖6C)。對(duì)經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證后的基因缺失毒株進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示ASFV-ΔMGF360-13L與ASFV CN/GS/2018比較，于MGF360-13L基因位置缺失1 063個(gè)核苷酸(MGF360-13L)，插入1 294個(gè)核苷酸(p72mCherry)，表明ASFV-ΔMGF360-13L毒株構(gòu)建成功。

A. MGF360-13L基因條帶擴(kuò)增:M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照 2.擴(kuò)增目的基因條帶(1 063 bp)。B.重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增：M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.載體對(duì)照(2 999 bp)；2.重組質(zhì)粒擴(kuò)增條帶(4 062 bp)A. Amplification of MGF360-13L; M. DNA relative molecular weight standard: 1. Negative control; 2. Amplification of the target gene(1 063 bp). B. PCR amplification of recombinant plasmid: M. DNA relative molecular weight standard; 1. Vector control(2 999 bp); 2. Amplification band of recombinant plasmid(4 062 bp)圖3 MGF360-13L基因PCR擴(kuò)增及載體酶切驗(yàn)證Fig.3 PCR amplification and vector enzyme digest verification of MGF360-13L gene

1.空白對(duì)照；2.轉(zhuǎn)染pAVX1-MGF360-13L在細(xì)胞中表達(dá)1. Blank control; 2. Transfected pVAX1-MGF360-13L was expressed in cells圖4 質(zhì)粒pAVX1-MGF360-13L 表達(dá)鑒定Fig.4 Expression and identification of plasmid pAVX1-MGF360-13L

圖5 ASFV-ΔMGF360-13L構(gòu)建策略示意圖Fig.5 The schematic diagram of ASFV-ΔMGF360-13L construction strategy

A.同源臂片段PCR擴(kuò)增:M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3、5. 陰性對(duì)照；2. MGF360-13L上游同源臂擴(kuò)增(1 000 bp)；4. MGF360-13L下游同源臂擴(kuò)增(1 000 bp)；6.p72mCherry基因擴(kuò)增(1 200 bp)。B.重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增:M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 載體對(duì)照(2 300 bp)；2. 重組質(zhì)粒擴(kuò)增條帶(5 499 bp)。C. ASFV-ΔMGF-360-13L純度PCR鑒定:M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 陰性對(duì)照；2.ASFV-ΔMGF360-13L基因組DNA為擴(kuò)增模板，無(wú)條帶；3. ASFV CN/GS/2018 基因組DNA為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增出目的基因MGF360-13L條帶(1 063 bp)A. PCR amplification of homologous arm fragment: M. DNA relative molecular weight standard; 1, 3, 5. Negative control; 2. Upstream homologous arm amplification of MGF360-13L(1 000 bp) 4. Downstream homologous arm amplification of MGF360-13L(1 000 bp); 6. p72mCherry gene amplification(1 200 bp). B.PCR amplification of recombinant plasmid: M. DNA relative molecular weight standard; 1. Carrier control(2 300 bp); 2. Amplification band of recombinant plasmid (5 499 bp). C.ASFV-ΔMGF-360-13L purity PCR identification: M. DNA relative molecular weight standard; 1. Negative control; 2. ASFV-ΔMGF360-13L genomic DNA as amplification template, without bands; 3.ASFV CN/GS/2018 genomic DNA was used as the amplification template, and the target gene MGF360-13L band was amplified(1 063 bp)圖6 重組轉(zhuǎn)移載體p72mCherry-MGF360-13L構(gòu)建及缺失毒純度鑒定Fig.6 Construction of recombinant transfer vector p72mCherry-MGF360-13L and purity identification of the gene deleted strain

Bright.自然光觀察結(jié)果；mCherry.熒光觀察結(jié)果；Merge.合并觀察結(jié)果；F1. 第一輪純化結(jié)果；F5. 第五輪純化結(jié)果；F9. 第九輪純化結(jié)果；F14. 第十四輪純化結(jié)果Bright. Natural light observation results; mCherry. Fluorescence observation results; Merge. Combined observation results; F1. The first round of purification rersults; F5. The fifth round of purification results; F9. The ninth round of purification results; F14. The fourteenth round of purification results圖7 ASFV-ΔMGF360-13L純化結(jié)果Fig.7 Purification result of ASFV-ΔMGF360-13L

2.4 ASFV-ΔMGF360-13L在PAMs細(xì)胞中的復(fù)制

用MOI=0.01的ASFV-ΔMGF360-13L與ASFV CN/GS/2018分別感染PAMs細(xì)胞，分別在感染2、24、48、72和96 h收取樣品，凍存于-70 ℃冰箱，并用解凍后的裂解液測(cè)定病毒滴度。結(jié)果顯示，ASFV-ΔMGF360-13L與ASFV CN/GS/2018在不同時(shí)間點(diǎn)的病毒量無(wú)顯著差異(圖8)。

2.5 ASFV-ΔMGF360-13L感染BMDM細(xì)胞后炎性因子的表達(dá)量

用MOI=1的ASFV-ΔMGF360-13L與ASFV CN/GS/2018分別感染BMDM細(xì)胞，在感染后4、8、12、24、48 h分別收集樣品，提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定總RNA濃度，使用qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子相對(duì)表達(dá)量，采用ELISA檢測(cè)上清液中炎性因子的含量。結(jié)果顯示，在ASFV-ΔMGF360-13L與ASFV CN/GS/2018感染后4 h時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子mRNA水平和蛋白水平無(wú)顯著性差異；在感染12 h后炎癥因子表達(dá)mRNA水平和蛋白水平存在顯著性差異(圖9A～F，P<0.05)。qPCR方法測(cè)定病毒拷貝數(shù)在不同時(shí)間點(diǎn)的增長(zhǎng)(圖9G)。

A. HAD50試驗(yàn)顯微鏡觀察結(jié)果:Bright. 自然光觀察結(jié)果；mCherry. 熒光觀察結(jié)果；Merge. 合并觀察結(jié)果；Mock. 陰性對(duì)照；ASFV CN/GS/2018. 親本毒株；ASFV-ΔMGF360-13L. 缺失毒株；B. ASFV-ΔMGF360-13L和ASFV CN/GS/2018體外生長(zhǎng)特性比較。ns. 差異不顯著(P>0.05)A.HAD50 experimental microscope observation: Bright. Natural light observation results; mCherry. Fluorescence observation results; Merge. Combined observation results; Mock. Negative control; ASFV CN/GS/2018. Parent strain; ASFV-ΔMGF360-13L. The gene deleted strain. B.Comparison of in vitro growth characteristics between ASFV-ΔMGF360-13L and ASFV CN/GS/2018. ns. No significant difference (P>0.05)圖8 血吸附試驗(yàn)觀察結(jié)果與病毒體外生長(zhǎng)比較Fig.8 The results of blood adsorption experiment were compared with the growth of virus in vitro

A、C、E. 感染后4、8、12、24、48 h時(shí)IL-1β、IL-6和TNF-α相對(duì)mRNA表達(dá)量；B、D、F. 感染后4、8、12、24、48 h時(shí)IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA結(jié)果；G. 不同時(shí)間點(diǎn)ASFV拷貝數(shù)；ns. 差異不顯著(P>0.05)；*、**、***. 差異顯著(P<0.05)A, C, E. The relative mRNA expression levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α at 4, 8, 12, 24 and 48 h after infection; B, D, F. The ELISA results of IL-1β, IL-6 and TNF-α at 4, 8, 12, 24 and 48 h after infection; G. ASFV copy number at different time points. ns. No significant difference (P>0.05)；*, **, ***. Significant difference(P<0.05)圖9 細(xì)胞炎性因子相對(duì)表達(dá)量及病毒拷貝數(shù)檢測(cè)Fig.9 Detection of relative expression level of cytokines and virus copy number

3 討 論

目前，ASFV仍然威脅著我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。由于免疫環(huán)境復(fù)雜且涉及多種免疫機(jī)制和免疫決定因素，ASFV疫苗的研發(fā)具有重重阻礙，目前尚沒(méi)有有效的疫苗，只能通過(guò)動(dòng)物檢疫和屠宰來(lái)控制疫情。

ASFV基因組編碼多達(dá)150到200個(gè)蛋白，其中大多數(shù)還沒(méi)有經(jīng)過(guò)功能鑒定，ASFV編碼的毒力基因、宿主-病毒相互作用方式和發(fā)病機(jī)制仍遠(yuǎn)未被了解[14]。因此，識(shí)別病毒蛋白功能，解析病毒在體內(nèi)和體外復(fù)制的規(guī)律，以及對(duì)病毒毒力基因的研究具有重要意義，是研發(fā)ASFV疫苗的一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

減毒活疫苗是有效開(kāi)發(fā)ASF疫苗的方法之一[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在高毒力ASFV-G中分別刪除9GL、UK和I177L等基因能夠致弱ASFV-G的致病性，其缺失毒株在免疫豬只后受到同源親本ASFV-G攻擊時(shí)獲得了一定的保護(hù)[16-17]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在高毒力ASFV-G中刪除MGF360-1L、X69R、J64R基因時(shí)并不減弱病毒毒力，與親本ASFV-G感染時(shí)引起的癥狀無(wú)明顯區(qū)別[18-19]。因此，在龐大的ASFV基因組篩選有效的毒力基因，是成功制備ASFV減毒活疫苗的關(guān)鍵。

現(xiàn)已知MGF家族蛋白在病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯和免疫逃逸等多個(gè)階段發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在高毒力ASFV-G中刪除MGF360和MGF505部分基因以及在高毒力ASFV CN/GS/2018中刪除MGF110-9L、MGF505-7R基因可以減弱親本ASFV毒力[8,12-13]。因此，本研究以MGF360-13L為對(duì)象進(jìn)行研究。通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MGF360-13L蛋白為親水性蛋白，且不具有跨膜區(qū)，也不是分泌蛋白；成功構(gòu)建了外源表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-MGF360-13L，在293T細(xì)胞中成功表達(dá)MGF360-13L蛋白；通過(guò)同源重組方法構(gòu)建了單基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L，并通過(guò)生長(zhǎng)曲線的繪制證明其在病毒復(fù)制中的非必需性。

ASFV有嚴(yán)格的細(xì)胞噬性，其主要靶細(xì)胞是巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，也有報(bào)道其在樹(shù)突狀細(xì)胞中復(fù)制[20]。這些細(xì)胞類(lèi)型在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[21]。其中，巨噬細(xì)胞是專(zhuān)門(mén)識(shí)別和破壞病原體并啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵，ASFV感染巨噬細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，ASFV病毒蛋白L83L能夠特異性結(jié)合宿主基因IL-1β, L83L基因缺失的ASFV毒株毒力并沒(méi)有減弱[23]，這也提示了ASFV致病過(guò)程的復(fù)雜性。本研究通過(guò)構(gòu)建基因缺失毒株，證實(shí)了MGF360-13L能夠抑制宿主炎性因子的表達(dá)。

4 結(jié) 論

在本研究中，使用生物信息學(xué)軟件分析了ASFV MGF360-13L基因的初步信息，成功構(gòu)建了外源表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-MGF360-13L，構(gòu)建了單基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L，證明該基因?yàn)锳SFV非必需基因，在感染BMDM細(xì)胞時(shí)，缺失毒株刺激細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平高于親本毒株，證明MGF360-13L基因在AFSV感染BMDM細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子應(yīng)答反應(yīng)具有一定的抑制作用。本文研究為進(jìn)一步揭示ASFV MGF360-13L基因功能做了鋪墊。