非洲豬瘟病毒p30蛋白單克隆抗體的制備及阻斷ELISA抗體檢測方法的建立

周改靜，羅俊聰，石正旺，萬 穎，楊 波，曹麗艷，宋 銳，田 宏，鄭海學

(中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 OIE/國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是一種有囊膜的大型DNA雙鏈病毒，是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是目前唯一已知的蟲媒DNA病毒[1-2]。野豬感染后一般形成持續性感染而不表現任何疾病形式，而家豬常表現為高熱、皮膚發紺、內臟器官出血、淋巴結腫大等癥狀[3-4]，且死亡率高達100%。由于ASFV基因組龐大，編碼蛋白復雜，免疫逃逸機制尚不清楚等[5]，迄今為止，全球范圍內仍沒有可用的商品化疫苗，非洲豬瘟(African swine fever，ASF)的防控及凈化仍面臨著巨大挑戰，因此，早期、快速、準確的檢測仍是目前國內外ASF防控的重要環節。

在目前已知的50多種ASFV結構蛋白中，p30、p54及p72因具有良好的免疫原性及保守性，是目前ASF血清學診斷的主要靶標[6]。其中，p30蛋白由CP204L基因編碼，位于內囊膜上，是ASFV最具有免疫原性的蛋白之一[4,7]，能誘導機體產生具有一定中和作用的抗體[8]，研究表明，在感染后7～10 d即可產生該抗體，且持續時間較長[9]。此外，p30是一個早期表達蛋白，研究表明，在感染后2 h便可檢測到該蛋白，并持續整個感染周期[10]，與其他蛋白相比，具有更高的抗體檢測效率，大大提高了陰性血清和陽性血清的區分能力[11]。綜上所述，p30是用于ASFV抗體檢測的一個良好靶標蛋白。

本研究將ASFVCP204L基因進行原核表達，并成功制備出1株具有良好阻斷效果的p30單克隆抗體，以此為基礎，建立了一種阻斷ELISA抗體檢測方法，可用于ASFV的感染診斷及流行病學調查，為ASF的防控提供一種有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-32a載體、SP2/0細胞、MA104細胞、ASFV陰性血清、豬瘟病毒(CSFV)陽性血清、O型口蹄疫病毒(FMDV-O)陽性血清、A型口蹄疫病毒(FMDV-A)陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性血清、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)陽性血清、塞內卡病毒(SVA)陽性血清均由中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存；ASFV CN/GS/2018分離株、ASFV滅活陽性血清及208份滅活豬血清樣品均由國家非洲豬瘟區域實驗室(蘭州)提供；ASFV基因缺失弱毒株由本實驗室制備[12]；BALB/c小鼠購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心；ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒購自西班牙Ingenasa公司；HRP Conjugation Kit-Lighting-Link?試劑盒購自Abcam公司；Ni柱親和層析樹脂購自OMEGA公司。

1.2 p30重組蛋白的制備及鑒定

將ASFVCP204L基因(GenBank ID：MK128995.1)構建至pET-32a載體中，將重組質粒pET-32a-p30轉化至E.coliBL21感受態細胞中。挑取單克隆菌落于含氨芐青霉素的LB培養基中培養，并用IPTG進行誘導表達。收集菌體，用PBS洗滌2次，超聲破碎后分離上清和沉淀，通過SDS-PAGE分析可溶性。用緩沖液(50 mmol·L-1Tris-HCl、2 mmol·L-1EDTA及100 mmol·L-1NaCl溶于PBS，pH 7.4)對菌體沉淀進行重懸并超聲，重復5次后，用8 mol·L-1尿素對沉淀進行溶解，并于4 ℃過夜透析至4 mol·L-1濃度。將溶解的包涵體蛋白加入平衡液平衡后的Ni柱中結合3～5 min，用50 mmol·L-1咪唑洗雜6次，100 mmol·L-1咪唑洗雜5次，最后用250 mmol·L-1咪唑洗脫目的蛋白。用SDS-PAGE分析純化結果，用Western blot鑒定與ASFV陽性血清的反應活性。

Western blot：用純化的p30重組蛋白進行SDS-PAGE，并轉印至NC膜上；5%脫脂乳室溫封閉2 h；用ASFV陽性血清(1∶500)4 ℃過夜孵育；PBST洗滌30 min，用HRP標記的豬二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h；PBST洗滌30 min，顯色液曝光。

1.3 p30單克隆抗體的制備及鑒定

用純化的p30重組蛋白以100 μg·只-1的劑量免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，免疫3次，間隔2周。取免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合[13]，采用間接ELISA及間接免疫熒光(IFA)方法篩選陽性雜交瘤細胞株。通過有限稀釋法對單克隆陽性孔進行3次亞克隆。對穩定分泌p30單抗的陽性孔進行擴大培養，并制備腹水。腹水單抗用正辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，并進行HRP標記。

間接ELISA：用純化的p30重組蛋白以2 μg·mL-1的濃度包被酶標板(50 μL·孔-1)；將雜交瘤細胞上清加入檢測孔中(50 μL·孔-1)，并設置陽性對照(融合鼠血清，1∶500)及陰性對照(SP2/0細胞上清)，37 ℃孵育30 min；PBST洗4次并拍干，加入HRP標記的鼠二抗(1：20 000，50 μL·孔-1)，37 ℃孵育30 min；PBST洗4次并拍干，加入TMB(50 μL·孔-1)，37 ℃顯色12 min(避光)；加入終止液(50 μL·孔-1)，酶標儀讀取OD450 nm值。

IFA：用1 MOI的ASFV CN/GS/2018分離株感染MA104細胞，同時設置陰性對照；培養48 h后棄培養基，加入4%多聚甲醛，室溫固定30 min；PBS洗3次，加入0.1% Triton，室溫通透10 min；PBS洗3次，加入5% BSA，室溫封閉1 h；PBS洗1次，加入雜交瘤細胞上清，4 ℃過夜孵育；PBST洗3次，加入FITC標記的鼠二抗(1∶100)，室溫孵育1 h；PBST洗3次，用DAPI染核10 min。置于熒光顯微鏡下觀察熒光并拍照。

1.4 p30阻斷ELISA方法的建立及反應條件的優化

根據方陣滴定法，用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)將p30重組蛋白從16 μg·mL-1倍比稀釋至0.125 μg·mL-1，分別包被至酶標板，50 μL·孔-1，4 ℃包被12 h；PBST洗4次并拍干，加入1% BSA，120 μL·孔-1，4 ℃封閉10 h；棄液并拍干。將ASFV陰、陽性血清用1% BSA分別作0、1∶2、1∶5、1∶10稀釋，同時設置空白對照孔(PBST)，50 μL·孔-1，每個稀釋度重復3孔，37 ℃孵育30 min；PBST洗4次并拍干，加入1∶20 000稀釋的酶標單抗，50 μL·孔-1，37 ℃孵育30 min；PBST洗4次并拍干，加入TMB(50 μL·孔-1)，37 ℃顯色12 min(避光)；加入終止液(50 μL·孔-1)，酶標儀讀取OD450 nm值。

根據阻斷率(percentage inhibition，PI)公式：PI(%)=(1-OD450 nm待檢血清/OD450 nm空白對照)×100，計算PPI(陽性阻斷率)和NPI(陰性阻斷率)。并根據公式：DPI=PPI-NPI，計算DPI(阻斷率差值)。選擇DPI值最高的反應條件作為最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

按照上述操作步驟，以確定的最佳抗原包被濃度和血清稀釋度繼續對最佳封閉液(1% BSA、5%脫脂乳、1%明膠)、血清孵育時間(15、30、45、60 min)、酶標單抗稀釋度(1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶30 000、1∶40 000、1∶50 000)、酶標單抗孵育時間(15、30、45、60 min)、底物顯色時間(5、10、15、20 min)等條件進行優化。

1.5 阻斷ELISA方法臨界值的確定

按照已優化的阻斷ELISA條件檢測155份血清樣品(62份ASFV滅活陽性血清和93份ASFV陰性血清)，計算每份樣品的PI值。用SPSS 23.0 軟件將PI值繪制成縱坐標為敏感性、橫坐標為(1-特異性)的ROC(receiver operating characteristic)曲線，并以Youden指數[Youden指數=敏感性-(1-特異性)]最大時對應的PI值為臨界值(cut-off值)[14-15]。

1.6 阻斷ELISA方法特異性檢測

按照已優化的阻斷ELISA條件檢測CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA陽性血清，同時設置ASFV陽性血清作為對照，每份樣品重復2次，計算PI值，評價該方法的特異性。

1.7 阻斷ELISA方法敏感性檢測

將ASFV陽性血清從原液開始倍比稀釋至1∶2 048，用本研究建立的阻斷ELISA方法與Ingenasa 公司生產的ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒同時進行檢測，分析該方法的敏感性。

1.8 阻斷ELISA方法重復性檢測

用同一批次包被的酶標板檢測隨機挑選的3份陽性血清和3份陰性血清，計算批內變異系數。并用3批次包被的酶標板對這6份血清進行檢測，計算批間變異系數。每個血清設置2個重復。

1.9 p30抗體檢測

為掌握p30抗體消長規律，用本方法對ASFV基因缺失弱毒株攻毒后的豬血清進行追蹤檢測。5頭豬編號分別為：Pig 1、Pig 2、Pig 3、Pig 4、Pig 5，分別于攻毒后第1～17天采集血清，間隔1 d。

1.10 臨床樣品檢測

用本研究建立的阻斷ELISA方法與Ingenasa 公司生產的ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒同時檢測208份豬血清，根據公式[16]計算Kappa值。若0

2 結 果

2.1 p30重組蛋白的純化及鑒定

SDS-PAGE分析顯示，該原核表達的p30重組蛋白主要以包涵體的形式存在(圖1A)，分子量約為45 ku，且Ni柱純化后具有較高的純度(圖1B)；Western blot結果顯示，純化后的p30蛋白與ASFV陽性血清具有良好的反應性(圖1C)。

2.2 p30單克隆抗體的制備及鑒定

用間接ELISA及IFA對雜交瘤細胞上清進行鑒定，并通過有限稀釋法對陽性孔進行3次亞克隆，最終獲得1株p30單抗，命名為3B2。間接ELISA結果顯示，該株單抗與p30蛋白具有良好的反應性(圖2A)；IFA結果顯示，該株單抗與ASFV具有良好的反應性(圖2B)。

M. 蛋白質分子質量標準；1. pET-32a-p30未誘導菌；2. pET-32a-p30誘導菌；3. pET-32a-p30誘導菌超聲上清；4. pET-32a-p30誘導菌超聲沉淀；5. 純化后的p30重組蛋白M. Protein marker;1. Non-induced pET-32a-p30; 2. Induced pET-32a-p30; 3. Ultrasonic supernatant of induced pET-32a-p30; 4. Ultrasonic precipitation of induced pET-32a-p30; 5. Recombinant p30 protein after purification圖1 p30重組蛋白的SDS-PAGE分析(A、B)及Western blot鑒定(C)Fig.1 Identification of recombinant p30 protein with SDS-PAGE (A, B) and Western blot (C)

圖2 p30單克隆抗體的間接ELISA(A)及IFA(B)鑒定Fig.2 Identification of p30 monoclonal antibody with indirect ELISA(A) and IFA(B)

2.3 阻斷ELISA方法最佳反應條件的確定

經條件優化，確定了該阻斷ELISA方法的最佳反應條件，如下：抗原最佳包被濃度為2 μg·mL-1，4 ℃包被12 h；最佳封閉液為1% BSA，4 ℃封閉10 h；待檢血清最佳稀釋度為原液，最佳孵育時間為37 ℃下孵育30 min；酶標單抗最佳稀釋度為1∶20 000，最佳孵育時間為37 ℃下孵育30 min；底物溶液最佳顯色時間為37 ℃下避光顯色15 min。

2.4 阻斷ELISA方法臨界值的確定

按照優化的反應條件檢測62份陽性血清和93份陰性血清，讀取OD450 nm值并計算PI值。用SPSS 23.0將PI值繪制成ROC曲線(圖3)，計算每個cut-off值對應的Youden指數。結果顯示，當PI臨界值為16.63%時，Youden指數達到最大值0.98，此時靈敏度為98%，特異性為100%(表1)，表明此時本方法具有較好的檢測準確性，因此，該方法的臨界值定為16.63%。

圖3 ROC曲線Fig.3 ROC curve

2.5 阻斷ELISA方法特異性檢測

用本研究建立的阻斷ELISA方法同時檢測ASFV、CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA陽性血清，結果顯示CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA陽性血清的PI值均低于16.63%，ASFV陽性血清的PI值遠高于16.63%(圖4)，表明該方法的特異性良好，與其他6種常見的豬病原無交叉反應。

2.6 阻斷ELISA方法敏感性檢測

用本研究建立的阻斷ELISA方法和Ingenasa 公司的阻斷ELISA抗體檢測試劑盒同時檢測從原液倍比稀釋至1∶2 048的ASFV陽性血清，結果顯示，本研究建立的阻斷ELISA方法最低能檢測到1∶128稀釋的ASFV陽性血清，Ingenasa公司的阻斷ELISA抗體檢測試劑盒最低可檢測到1∶256稀釋的ASFV 陽性血清(圖5)，兩者相差一個稀釋度，表明本方法敏感性良好。

表1 不同臨界值下的敏感性和特異性

圖4 阻斷ELISA特異性檢測結果Fig.4 The specificity results of blocking ELISA

圖5 本方法與Ingenasa 阻斷ELISA敏感性檢測結果Fig.5 The sensitivity results of the blocking ELISA method established in this study and the Ingenasa method

2.7 阻斷ELISA方法重復性檢測

用本研究建立的阻斷ELISA方法檢測3個陽性血清和3個陰性血清，進行批內和批間試驗，結果顯示，批內變異系數為0.28%～7.80%，批間變異系數為2.14%～9.16%，批內、批間變異系數均小于10%(表2)，表明該方法具有良好的重復性。

2.8 p30抗體檢測

由圖6抗體消長曲線可知，5頭豬在攻毒后第7天開始產生免疫應答，第9天抗體均轉陽，之后抗體水平逐漸升高，與之前的研究報道[9]基本一致。

表2 重復性試驗結果

圖6 p30抗體消長曲線Fig.6 The curve of p30 antibody growth and decline

2.9 臨床樣品檢測

用本研究建立的阻斷ELISA方法與商品化的Ingenasa ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒同時檢測208份豬血清樣品，根據公式計算Kappa值。結果顯示，Kappa值為0.96>0.75，表明本研究建立的阻斷ELISA方法與商品化試劑盒具有高度一致性(表3)。

表3 比對試驗結果

3 討 論

ASFV感染家豬后致死率可高達100%，而我國作為世界上最大的生豬養殖和消費國，近年來受到該病的毀滅性打擊[18]。在沒有有效疫苗及治療性藥物的形勢下，早期的診斷檢測對ASF防控至關重要。隨著疫病的發展和流行，國內耐過豬、亞臨床癥狀的長期感染豬及弱毒性的基因突變缺失毒株不斷出現，單一的病原學檢測或血清學檢測已不能滿足對ASFV感染豬進行監測的需要，聯合核酸檢測與血清學抗體檢測的方法成為新形勢下我國ASF防控與凈化的重要手段，但國內尚無批準的抗體檢測試劑盒，國外有西班牙Ingenasa公司、瑞典Svanova公司和法國ID Vet公司生產的試劑盒[19-20]，但價格都比較昂貴，因此，亟需研制出國內可用的,精準、快速的ASFV抗體檢測方法。

p30蛋白因具有免疫原性好、保守性好、早期表達且長期存在等特點，成為ASFV診斷檢測的重要靶點。2000年Barderas等[21]及2006年Pérez-Filgueira等[22]均基于p30蛋白建立了與OIE推薦方法敏感性相當且特異性更好的ELISA檢測方法，2016年Giménez-Lirola等[9]基于p30蛋白建立了可檢測感染后8～10 d血清和口腔液中ASFV抗體的間接ELISA方法，2021年于浩洋等[23]基于真核表達的p30蛋白也建立了具有良好特異性和敏感性的阻斷ELISA方法。此外，p30蛋白也已被應用到商品化ELISA檢測試劑盒中，例如ID-Vet公司研制的ASFV間接及競爭ELISA抗體檢測試劑盒。

本研究建立的p30阻斷ELISA檢測方法與同年于浩洋等[23]建立的相比，待檢血清及酶標二抗孵育時間均減少一半，且待檢樣品無需稀釋，總的檢測時間相對縮短1 h，與Ingenasa公司生產的ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒相比也減少了至少0.5 h。本方法的臨界值是由ROC曲線分析所得，ROC曲線是用真陽性率(敏感性)和假陽性率(1-特異性)作圖所得出的[24]，它可表示靈敏度和特異度之間的相互關系。然后通過計算Youden指數來篩選該方法的最佳臨界值，Youden指數=敏感性-(1-特異性)，Youden指數越大，所對應的臨界值越具有真實性[15, 25]。這種方法與陰性對照平均值±2SD或3SD確定臨界值的方法相比，權衡了敏感性與特異性，所確定的臨界值最大可能地降低了假陽性與假陰性之和[26]，因此是目前最具有科學性的一種臨界值確定方法。本方法的Youden指數最大為0.98，此時，敏感性為98%、特異性為100%，所對應的阻斷率即臨界值為16.63%，這表明該方法具有較好的陰性和陽性血清區分能力。

研究結果表明，本方法具有較好的特異性，與目前豬場常見的其他6種豬病毒的陽性血清均不發生交叉反應；最低可以檢測出1∶128稀釋的陽性血清；批內及批間變異系數均小于10%，具有良好的重復性。Kappa統計量作為一種矯正機遇可能后衡量一致性的方法，在獸醫實驗室中評估兩種檢測方法、兩臺儀器設備等的符合程度及同一種方法多次測定結果是否可以重現方面均有適用性，Kappa值越大，表明兩者的一致性越高。本研究用Kappa值來評估本方法與商品化試劑盒檢測結果的一致性，與國內同類研究相比排除了機遇因素，更具有科學依據[17]。此外，利用本方法追蹤檢測ASFV基因缺失弱毒株攻毒后的血清抗體水平，數據顯示攻毒后第9天抗體均為陽性，這與之前研究報道[9]基本一致，進一步說明本方法可用于ASFV感染動物的檢測以及豬群ASFV抗體的監測。

4 結 論

本研究利用原核表達系統成功表達了p30蛋白，并篩選到1株具有良好阻斷效果的p30單克隆抗體；基于該蛋白及阻斷單克隆抗體成功建立了一種操作簡便、快速，且具有良好特異性、敏感性及重復性的阻斷ELISA方法。本方法與商品化試劑盒相比具有高度一致性，可用于ASF的臨床樣品檢測、流行病學調查及豬群免疫水平監測。本方法將進一步優化測試以形成商品化的ASFV抗體檢測試劑盒，為我國ASF的防控提供技術支撐。