泌乳牛不同胎次干奶期瘤胃發酵指標與甲烷產量的特征

劉志豪，賈 鵬，賴 琦，董利鋒，吳秋玨，高彥華，田忠紅，刁其玉*

(1.中國農業科學院飼料研究所/反芻動物及其幼畜營養代謝中美聯合研究中心，北京 100081；2.河南科技大學動物科技學院，洛陽 471003； 3.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041；4.山東銀香偉業集團有限公司，菏澤 274000)

人類活動向環境中排放大量的溫室氣體是全球變暖和極端氣候問題的主要原因。溫室氣體主要包括二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)、氧化亞氮(N2O)等[1]，其中CH4的排放量雖然遠遠低于CO2，但是造成的危害性遠遠高于CO2，其增溫趨勢是CO2的28倍[2]。而反芻家畜胃腸道CH4排放是人類農業活動產生的最主要的CH4排放源之一，其約占農業CH4總排放量的59%，約占世界CH4總排放量的 17%，是絕對不可忽視的一大來源[3-4]。反芻動物瘤胃內微生物降解生成揮發性脂肪酸時產生H2和CO2，產甲烷菌可利用H2生成CH4[5]，這部分CH4將造成奶牛6%～10%的能量損失[6]。因此，降低反芻動物瘤胃CH4排放對于節約飼料能源和減緩全球變暖均有著重要意義。

我國作為奶牛養殖大國，目前奶牛瘤胃CH4排放規律方面已有大量研究，王貝[7]采用六氟化硫(SF6)示蹤技術對泌乳早期(391.86 g·d-1)、泌乳中期(399.8 g·d-1)和泌乳后期(395.61 g·d-1)的奶牛瘤胃CH4排放量進行了測定，李斌昌[8]對9月齡(97～118 g·d-1)、12月齡(119～159 g·d-1)、15月齡(194～230 g·d-1)月齡后備奶牛CH4排放量進行了測定，發現隨著月齡增加，CH4排放量逐漸增加；王小林[9]則對犢牛(130.6 L·d-1)、青年牛(261.7 L·d-1)和干奶牛(340.5 L·d-1)的 CH4排放進行了測定，發現不同生理階段奶牛隨著年齡和體重增加，CH4排放量極顯著增加。目前，國內主流的CH4測定方法為呼吸室測定和SF6示蹤技術測定，與前兩者相比，GreenFeed測定系統具有自動化、無創、非侵入性的特點，可用于大批量動物的測定，而我國通過GreenFeed測定系統對自然條件下奶牛CH4排放的研究尚處于空白，尤其是對于處于干奶期的不同胎次的荷斯坦奶牛的研究較少。干奶期在奶牛生產過程中至關重要，此階段牧場往往會調整飼糧配方，奶牛的采食量也會出現降低，這兩者的變化會對瘤胃內溫室氣體排放量產生顯著的影響。假設干奶牛的CH4排放量隨著胎次和體重的增加而增加，本研究擬通過GreenFeed測定系統，系統測定不同胎次的干奶牛的CH4排放和瘤胃發酵指標，在此基礎上建立瘤胃CH4預測模型，旨在探究奶牛瘤胃CH4排放規律，為提高奶牛能量利用效率和開發減排調控方法提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

本試驗于2020年10—11月在山東省菏澤市曹縣銀香偉業公司第三國際牧場完成。

1.2 試驗動物與試驗設計

本試驗選取48頭體況健康，處于干奶期的荷斯坦奶牛，按照胎次將試驗動物分為4個處理組，每組12頭牛，4個處理組如下：一胎牛組、二胎牛組、三胎牛組、四胎及以上組。日糧配方參照NRC(2001)中干奶牛營養需要配置，以全混合日糧(TMR)形式飼喂，日糧的組成及其營養成分見表1。本試驗預試期5 d，正試期40 d(產前60 d～產前15 d)。

表1 試驗飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.3 飼養管理

試驗所有用牛均采用舍飼，每天喂料兩次(07:00和15:00)，自由采食和飲水，每天清理剩料，定期清理水槽，保證飼料和飲水的清潔性。所有奶牛的飼喂方式、飼養環境和飼糧均保持一致。

1.4 測定指標和方法

1.4.1 GreenFeed測定系統 該系統由美國某公司研發，配備有頭室、抽風機和顆粒料飼養器，可以在奶牛正常進食條件下，測定奶牛排出的CH4，本研究使用的GreenFeed系統為我國引進的第一套設備。當奶牛采食時，通過激光束保證牛的頭部處于正確位置，抽氣扇以大約20～40 L·s-1的速度從動物的鼻子吸入空氣，系統內的非色散紅外分析儀會連續測量空氣中的CH4濃度，同時測量空氣流量、溫度和相對濕度。每次動物訪問GreenFeed測定系統時，CH4排放量計算公式如下：

CH4volume(L)=visit time (min)[CH4animal (%)-CH4background (%)]×air flow (L·min-1)[10]

式中：CH4volume——奶牛甲烷的排放量；

visit time——動物測定時間；

CH4animal——測定期間甲烷的平均濃度；

CH4background——背景空氣(即測定系統中沒有動物訪問時)的甲烷的平均濃度；

air flow——測定期間氣體的流速；

GreenFeed測定系統收集的數據包括動物測定次數、每次測定時間和持續時間、背景環境中的溫度和濕度以及測定時的CH4濃度，并將所獲得數據實時上傳至服務器，由測定系統生產商進行數據處理后得到最終的測定結果。

1.4.2 基本數據測定 體重的測定：于正式試驗結束前5 d，于晨飼前測定每頭奶牛的體重。

干物質采食量的測定：在整個試驗期間，每天記錄投料量和剩料量，計算每頭奶牛的日采食量，通過對試驗期間采集日糧的干物質含量測定，計算出奶牛每天的干物質采食量。

1.4.3 瘤胃液采集與瘤胃發酵指標測定 于正式試驗結束前3 d，晨飼后3 h通過口腔導管的方式采集瘤胃液樣品，使用便攜式pH計立即測定pH，隨即將所取的瘤胃液樣品用4層紗布過濾后，分裝于2個10 mL離心管，保存于-20 ℃，留待測定揮發性脂肪酸，氨態氮和微生物蛋白。

其中揮發性脂肪酸(VFA)采用氣相色譜儀(6890 N, Agilent，美國)測定。色譜柱為HP19091 N-213型毛細管柱，進樣口溫度為200 ℃，載氣為高純氮氣，流量為2.0 mL·min-1。火焰氫離子檢測器的溫度為250 ℃[11]。

氨態氮(NH3-N)：水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法測定[12]。

微生物蛋白(MCP)：使用嘌呤堿基法進行測定[13]。

1.4.4 瘤胃甲烷排放測定 CH4排放量的測定采用GreenFeed測定系統進行測定。測定過程中，保持每頭牛每天最多可訪問GreenFeed測定系統4次，每天最少訪問2次，每次持續測量時間在3 min以上，每次訪問間隔6 h。為保證數據準確性，每頭牛需測量30次以上，以其平均值為CH4排放量[14-16]。

1.4.5 飼料樣品的采集與分析 于正試期第15～17天，用四分法采集飼料樣品，于65 ℃烘箱中烘干48 h后，回潮24 h制成風干樣，粉碎后過40目網篩留待測定干物質(dry matter, DM)、粗蛋白質(crude protein, CP)、粗脂肪(ether extract, EE)、粗灰分(Ash)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)和總能(gross energy, GE)，測定方法參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[17]。

1.5 統計分析

通過Excel 2020進行數據處理，采用SPSS 22.0軟件對數據正態分布檢驗(正態Q-Q圖和正態P-P圖)和方差齊性檢驗，剔除異常值后進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行差異顯著性分析，采用Pearson相關分析進行相關性分析，采用SPSS構建線性回歸模型，試驗結果以P<0.05為差異顯著，以P>0.05為差異不顯著。

2 結 果

2.1 試驗干奶?；倔w況

由表2可知，各個胎次的年齡之間均有顯著差異(P<0.05)，三胎和四胎及以上組干奶牛的體重、代謝體重顯著高于一胎組和二胎組(P<0.05)，而一胎和二胎組之間，三胎和四胎及以上組之間無顯著差異(P>0.05)。試驗干奶牛的體重隨著年齡的增加而增加，代謝體重與體重變化規律一致，干物質采食量的估測數據為12.38 kg·d-1。

表2 試驗中干奶?；倔w況

2.2 胎次對干奶牛瘤胃發酵指標的影響

如表3所示，三胎組牛的NH3-N顯著高于一胎組(P<0.05)，與二胎和四胎及以上組之間沒有顯著差異(P>0.05)，一胎、二胎、四胎及以上組的NH3-N也沒有顯著差異(P>0.05)；一胎和二胎牛的瘤胃微生物蛋白顯著高于四胎及以上組(P<0.05)，與三胎組無顯著差異(P>0.05)，一胎和二胎之間，三胎和四胎及以上組之間均無顯著差異(P>0.05)；一胎組瘤胃中戊酸顯著低于三胎組(P<0.05)，與二胎和四胎之間無顯著差異(P>0.05)。此外，瘤胃中pH、TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和乙丙比在各個胎次之間均無顯著差異(P>0.05)。

表3 胎次對干奶牛瘤胃發酵指標的影響

2.3 胎次對瘤胃甲烷產量的影響

由表4可知，干奶牛的CH4排放量的平均值為336 g·d-1，最大值為477 g·d-1，最小值為250 g·d-1，中位數為334 g·d-1。CH4/代謝體重的平均值為2.31 g·kg-1，最大值為3.04 g·kg-1，最小值為1.86 g·kg-1，中位數為2.29 g·kg-1。

表4 干奶牛瘤胃甲烷產量

由圖1可知，干奶牛的瘤胃CH4排放量在一胎組最低，三胎和四胎及以上組瘤胃CH4排放量顯著高于一胎組(P<0.05)，二胎、三胎和四胎及以上組之間沒有顯著差異(P>0.05)，一胎組和二胎組之間沒有顯著差異(P>0.05)；各處理組之間的CH4排放量/代謝體重無顯著差異(P>0.05)。

*. 表示相關性顯著(P<0.05)，**表示相關性極顯著(P<0.01)*. Indicates significant correlation, ** indicates a extremely significant correlation圖1 胎次對干奶牛甲烷排放量的影響Fig.1 The effect of parity on methane emissions of dry dairy cows

2.4 干奶牛瘤胃甲烷排放量與體況和瘤胃發酵特征的相關關系

由表5可知，干奶牛的CH4排放量與胎次和體重均有著極顯著的相關關系(P<0.01)，而與TVFA、乙酸、丙酸和乙丙比之間沒有顯著的相關關系(P>0.05)。對CH4排放量和體重進行回歸分析可得到方程(圖2)。

表5 干奶牛甲烷排放量與體況及瘤胃發酵特征的相關性

圖2 基于體重的干奶牛CH4排放量預測模型Fig.2 Prediction equations of enteric methane emissions based on body weight

3 討 論

3.1 胎次對干奶牛瘤胃發酵指標的影響

瘤胃pH是反映瘤胃酸堿平衡狀況和瘤胃微生物所處環境是否正常的重要生理指標，正常范圍在6.2～7.0之間[18]，本試驗中各個處理組干奶牛瘤胃pH均處在正常范圍。NH3-N是微生物合成菌體蛋白的前體物質，瘤胃內氨態氮濃度反映瘤胃內氮代謝的平衡情況，其質量濃度范圍在6.58～36.7 mg·dL-1內較佳[19-20]，本試驗各個處理組干奶牛瘤胃NH3-N均在此范圍內，能夠滿足微生物蛋白合成所需。瘤胃NH3-N濃度反映了瘤胃內微生物對日糧蛋白的降解速度，其含量既受到日糧組成的影響，也與瘤胃內微生物的利用速率密切相關[21]。本試驗中三胎牛的瘤胃氨態氮濃度最高，顯著高于一胎牛，這可能是由于一胎組試驗牛的瘤胃微生物利用氨態氮合成更多的微生物蛋白，試驗測定的結果也表明一胎組牛瘤胃微生物蛋白含量高于三胎組牛。瘤胃揮發性脂肪酸是反芻動物能量利用過程中的重要產物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸等，是反芻動物能量的主要來源[22]。瘤胃揮發性脂肪酸主要受日糧組成、日糧加工方式、飼喂方式等的影響[23]。本試驗中各個處理組的總揮發酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸均無顯著差異，這可能是由于試驗中所有干奶牛均采用同樣的日糧和飼喂方式，而戊酸雖然在一胎和三胎組之間出現顯著性差異，但其占總揮發性脂肪酸的比例極小，戊酸的含量和比例也處在合理的區間范圍內。Khazanehei等[24]對二胎和三胎及以上干奶牛的研究也表明，胎次對乙酸、丙酸、丁酸和其他揮發性脂肪酸沒有影響，但其研究結果也發現，二胎牛的總揮發性脂肪酸顯著高于三胎及以上牛。本試驗中，各個胎次干奶?？倱]發性脂肪酸之間沒有統計學上的顯著差異，但一胎牛的總揮發性脂肪酸最高，這可能是由于與頭胎牛相比，經產牛每次采食速度更快，反芻效率更高，咀嚼等量飼料所需時間更少[25]，在短時間內采食大量的飼料和有效咀嚼可能會增加瘤胃通過率，從而通過該途徑增加瘤胃通過VFA的能力[24]。

3.2 胎次對干奶牛瘤胃甲烷排放量的影響

CH4是反芻動物攝入的日糧在瘤胃中微生物發酵作用下產生的一種溫室氣體。本試驗使用國際先進的GreenFeed測定系統測定出干奶牛的CH4排放量處于250～477 g·d-1，平均CH4為336 g·d-1。Kasuya和Takahashi[26]的研究表明，干奶牛的CH4排放量處于285.2～396.5 L·d-1，其測定的范圍小于本試驗結果，這可能是因為本研究所測定的奶牛涉及到各個胎次，體重上有著更大的差異。本研究發現，隨著胎次增加，干奶牛的瘤胃CH4排放量也逐漸增加，尤其是三胎組和四胎及以上組干奶牛瘤胃CH4排放量顯著高于一胎組，而用單位代謝體重來衡量CH4排放強度時，發現各個胎次組之間的CH4/代謝體重均無顯著差異。Neel等[27]的研究也表明，不同體重的牛其瘤胃CH4排放量在用單位代謝體重表示時其差異消失。這表明干奶牛瘤胃CH4排放量的差異可能是由于體重差異所造成的。Huhtanen等[28]基于瘤胃功能建模發現，單位干物質采食量CH4排放量的增加與飼料在瘤胃中的滯留時間、有機物消化率的增強和微生物細胞合成效率降低有關。較大體重的奶牛有著更大的瘤胃容量，減少了攝入對日糧在瘤胃中平均停留時間的影響，導致平均瘤胃停留時間增加。由于奶牛攝入的日糧中較易發酵部分先發酵，平均瘤胃停留時間的增加將會導致日糧纖維素在瘤胃中被消化的比例更大，而更大比例的瘤胃纖維素消化則會導致CH4產量增加[29]。

3.3 干奶牛瘤胃甲烷排放預測模型

反芻動物瘤胃CH4排放量的精準測定是核算溫室氣體排放和研究減排措施的基礎，目前測定反芻動物瘤胃CH4排放量的方法主要包括直接測定法(呼吸代謝室法、六氟化硫示蹤法、GreenFeed測定系統等)和間接測定法(CO2示蹤法、嗅探器法、激光檢測器法等)[16,30]，但無論哪種測定方法，在實際生產中測定CH4排放量都需要耗費大量人力物力，無法對所有動物全部進行測定。因此，需要根據反芻動物實測的CH4排放數據，應用統計方法建立的預測模型，核算排放因子，來預測動物的CH4排放量。本試驗結果表明，干奶牛的CH4排放量與胎次(相關系數=0.47)和體重(相關系數=0.61)之間均存在著極顯著的正相關關系。Bird-Gardine等[31]對安格斯母牛和公牛的CH4排放量進行測定，發現其瘤胃CH4排放量與體重之間有著顯著的相關性，相關系數分別為0.74和0.66；Herd等[32]測定41頭安格斯牛的CH4排放量，也得到了相似的結果，相關系數為0.47；Donoghue等[33]測定了不同生長階段的安格斯牛的CH4排放量，發現其與斷奶(相關系數0.53)、一歲(相關系數0.61)和成年后(相關系數0.56)的體重均有顯著的相關性；Jonker等[34]在母羊和羔羊上也發現了相似的結果，其利用兩種呼吸室測定CH4，發現CH4排放量與體重呈顯著的正相關，相關系數為0.31～0.61。這表明反芻動物體重越大，其CH4排放量就越高。在CH4排放量和體重呈極顯著正相關的基礎上，基于奶牛體重建立的預測模型的決定系數為R2=0.46。Bird-Gardine等[31]在安格斯母牛和公牛也基于體重建立了瘤胃CH4排放量線性預測模型，決定系數分別為0.46和0.26；Huhtanen等[35]在奶牛上的研究也得出CH4排放量與體重之間的預測模型決定系數R2=0.32；Jiao等[36]基于6、12、18和22月齡奶牛的甲烷排放量和體重建立預測模型發現其決定系數分別為0.26、0.34、0.18和0.45；董利鋒等[37]對后備奶牛的研究也表明基于體重及建立的CH4預測模型決定系數為0.42。與單一的指標相比，增加預測模型中變量數量，建立多元預測模型有助于提高模型的決定系數，Jenstch等[38]基于日糧中各種可消化營養物質建立的四元一次模型決定系數達到0.896，而Jiao等[36]基于代謝能攝入量、中性洗滌纖維采食量和粗飼料比例建立的三元一次模型決定系數達到0.95，具有較高的模型精度。但在實際生產中，想要大量精確的測得這些指標十分困難，因此有必要使用易于獲得的指標來構建高精度預測模型。本試驗基于舍飼生理狀態和干奶期生理階段的荷斯坦奶牛，建立適用于我國典型養殖模式的奶牛CH4排放量預測模型，為我國精準核算溫室氣體排放提供一定的數據，也為研究分析出最佳飼料配方及相關的減排措施提供參考。

4 結 論

在本試驗條件下，干奶牛CH4排放量處于250～477 g·d-1，平均CH4排放量為336 g·d-1，隨著胎次的增加，CH4排放量呈增加的趨勢，一胎最低，四胎最高。此外，CH4排放量與胎次和體重之間呈極顯著的正相關，基于體重建立的線性預測模型能夠用于反映和評估干奶時期奶牛的CH4排放量。