CYP19A1調控內源性雌激素合成促進牦牛COCs細胞自噬和早期發育能力

王立斌，王 萌，孫 瑩，陳 睿，張甜甜，黃振華，張 倩，余四九，潘陽陽*

(1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070； 2.甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心，蘭州 730070)

雌激素(17β-estradiol, E2)作為雌性動物主要類固醇類激素，由膽固醇產生，性腺分泌[1]，在動物卵母細胞成熟、排卵、胚胎發育等生理過程中的生物效應因動物種類不同存在一定差異[2]。在水牛[3]、山羊[4]和豬卵母細胞成熟過程加入外源E2或促進內源E2合成與分泌，能夠改善卵母細胞成熟，增加卵丘細胞擴散。研究發現，動物機體中E2可激活機體多種細胞雌激素受體(estrogen receptor, ESR)，調控細胞自噬相關蛋白，改變細胞和組織形態[5-6]。E2調控細胞自噬分子機制存在多樣性，如增加細胞溶酶體數量、抑制自噬相關micRNA、影響細胞組蛋白修飾等，且作用靶基因較多，如自噬相關基因5(autophagyrelated gene 5, ATG5)、微管相關蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3, LC3)和Bcl-2同源結構域蛋白(Bcl-2 homologous domain protein, BECLIN1)[7]。

細胞自噬作為一種基本且相對保守的細胞分解代謝程序，在細胞生長過程中不斷變化，參與細胞成份降解與再利用[7]，同時參與機體眾多發育和生理生物學事件，如細胞存活與死亡、新陳代謝和天然免疫等。自噬可維持細胞在不同應激條件下的存活，提高其對饑餓、低氧、生長信號阻斷等應激的適應，降低應激條件下機體疾病發生率、緩解發育障礙[8-9]。哺乳動物卵母細胞成熟過程中細胞自噬可改變胞內線粒體分布和Ca2+含量，提高卵母細胞對氧化應激的適應能力，并通過恢復線粒體功能、降低卵母細胞凋亡相關蛋白酶延緩細胞凋亡啟動[10]。牦牛作為長期生活在青藏高原地區的典型家畜，其生殖生理具備適應高寒、低氧等特性[11]，分析牦牛卵泡發育和卵母細胞成熟過程中生殖激素調控細胞自噬對提升牦牛繁殖水平具有重要意義。

細胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450arom, CYP19A1)作為大多數動物性腺激素合成關鍵酶[12]，主要分布于動物性腺、肝、脂肪和腦等組織[13]。降低人和其他動物顆粒細胞CYP19A1表達水平，導致E2分泌減少[14-15]，機體內CYP19A1表達量與類固醇類激素水平及生殖疾病緊密相關[15]。動物顆粒細胞中CYP19A1表達受其他激素影響，如促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)可調控CYP19A1轉錄誘導E2合成，同時促進顆粒細胞增殖[16]。本試驗在牦牛卵母細胞體外成熟過程調控COCs中CYP19A1表達，分析其對內源性E2合成和細胞自噬的影響，并與外源性E2調控牦牛卵母細胞自噬與發育能力的效果進行比較，為進一步探索細胞色素酶介導生殖激素調控家畜卵母細胞發育的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

牦牛卵巢采自青?；ブh牦牛屠宰場，M199家畜卵母細胞成熟培養液、E2、FSH與促黃體生成素(luteinizing hormone, LH)、胚胎培養用G1液均購自瑞典Vitrolife生物公司。透明質酸酶、去離子霉素、二甲基氨基嘌呤等孤雌激活胚胎生產試劑、CYP19A1一抗(SAB4500606)購自美國Sigma公司。微量細胞RNA提取試劑盒、兩步法反轉錄試劑盒購自美國公司Omega生物公司，SYBR Green II熒光定量PCR試劑盒購自寶生物(大連)公司，牛E2ELISA檢測試劑盒購自上海仁捷生物科技有限公司，細胞自噬相關因子一抗ATG5(bs-25013R)、BECLIN1 (bsm-33315M)、β-actin(bsm-33036M, 42 ku)購自北京博奧森生物技術有限公司、LC3(ab51520)抗體購自abcam生物公司，Western blot和免疫熒光技術檢測用的二抗均購自北京博奧森生物技術有限公司，其中bs-0295D用于Western blot檢測CYP19A1、ATG5、LC3，bs-0297R用于Western blot檢測BECLIN1，bs-0295D-AF488用于免疫熒光檢測CYP19A1、ATG5，bs-0297R-FITC用于免疫熒光檢測BECLIN1，試驗所用其他試劑均購買碧云天(南京)生物公司。

1.2 牦牛COCs采集與體外成熟培養

從屠宰牦牛體內立刻采集卵巢，用含有1%雙抗(青鏈霉素)的生理鹽水約30 ℃洗滌3次，置于32～35 ℃無菌保溫壺，6 h內帶回細胞實驗室，用細胞培養箱內平衡的生理鹽水洗滌卵巢3次，采用攜帶12～18 G針頭注射器從直徑為5～10 mm卵泡中抽吸牦牛卵丘卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes, COCs)，體視顯微鏡下挑選形態完整，至少包裹3層顆粒細胞的未成熟COCs(圖1A)。用預熱洗卵液(M199+5%血清)在顯微鏡下輕微吹打洗滌3次，置于4孔板(Nunclon，176740)，每400 μL M199卵母細胞成熟培養液(M199基礎液+5% FBS+50 μg·mL-1LH +100 μg·mL-1FSH 100 μg·mL-1鏈霉素+ 100 μg·mL-1青霉素)含50枚COCs，用200 μL礦物油覆蓋，放入37.5 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養24 h，收集成熟COCs。根據試驗設計所需，參照團隊前期研究成果和相關文獻報道，在卵母細胞成熟培養液分別加入10-7mol·L-1E2[17]、10-6mol·L-1黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)誘導CYP19A1表達[18]和10-5mol·L-1雙酚A(bisphenol A, BPA)抑制CYP19A1表達[19]，并設對照組(加入等體積生理鹽水)。

培養24 h后，收集成熟COCs(圖1B)，每個處理組3個重復，每個重復300枚COCs，其中230枚用DPBS清洗3次后置于-70 ℃保存，用于后續CYP19A1和細胞自噬相關因子mRNA和蛋白Western blot檢測，分別為30枚和200枚，20枚用DPBS清洗3次后置于免疫熒光固定液，用于后續CYP19A1和自噬相關蛋白免疫熒光檢測。剩余COCs用DPBS清洗3次，每次5 min，用0.1%的透明質酸酶進行吹打清洗，直到完全去除卵丘細胞，獲得裸卵，將其置入DPBS清洗3次，用吸卵針輕微吹打旋轉卵母細胞，根據第一極體排出確定卵母細胞成熟(圖1C)，統計卵母細胞成熟率，并將成熟卵母細胞收集生產孤雌激活胚胎。

1.3 CYP19A1與細胞自噬相關因子mRNA和蛋白表達檢測

1.3.1CYP19A1與細胞自噬相關因子mRNA表達檢測 在不同處理組收集30枚牦牛COCs，DPBS清洗3次，參照微量細胞RNA提取試劑盒操作程序提取RNA，按照反轉錄試劑盒程序合成cDNA，實驗室冷凍保存備用。根據GenBank儲存的牛CYP19A1、ATG5、BECLIN1、LC3 mRNA序列，在保守區設計特異性引物，具體信息見表1。反應管中加入2.00 μL cDNA，正義鏈和反義鏈引物各0.50 μL，使其工作濃度為0.20 μmol·mL-1，qRT-PCR mix SYBR GreenⅡ(2×) 10 μL，最后加入7.00 μL滅菌水至終體積20.00 μL。采用Roche 480實時熒光定量RCR儀擴增檢測不同處理組COCs中CYP19A1、ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ mRNA水平，條件為96 ℃預變性1 min，PCR反應循環數為38，包括變性(96 ℃, 20 s)、退火(59.5 ℃, 15 s)、延伸(72 ℃, 20 s)，β-actin作為內參基因，等體積生理鹽水處理組為對照組，不同處理組mRNA水平采用相對模板量算法分析，用2-ΔΔct表示[20]。

表1 Real-time PCR所用引物信息表

1.3.2 CYP19A1與細胞自噬相關因子蛋白表達Western blot檢測 參照英文特(SD-001)動物細胞蛋白提取試劑盒，從每個處理組中選取200枚牦牛COCs提取總蛋白，100 ℃水浴10 min進行蛋白SDS變性，等量上樣至10%凝膠，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白。220 mA冰浴電轉1 h，將目標蛋白轉移至0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，5%脫脂奶粉溶解于TBST溶液常溫封閉2 h，CYP19A1、ATG5、BECLIN1、LC3蛋白一抗4 ℃孵育至少10 h，TBST溶液清洗3次，每次10 min，生物素標記的二抗37 ℃孵育1 h，TBST溶液清洗5次，每次5 min，采用ECL試劑發光顯色，用化學發光儀進行拍照。通過灰度值分析，以β-actin蛋白作為參照，采用相對定量方法比較不同處理組CYP19A1、ATG5、BECLIN1、LC3蛋白表達水平。

1.3.3 CYP19A1與細胞自噬相關因子蛋白表達免疫熒光技術檢測 每個處理組選取40枚COCs，DPBS清洗3次，每次5 min，用免疫染色液進行固定，4 ℃保存備用。挑選15枚用于CYP19A1與細胞自噬相關因子蛋白表達定位檢測，因LC3含有兩個亞型，無法用免疫熒光抗體進行區分，細胞自噬相關因子只檢測ATG5、BECLIN1蛋白熒光。從固定液取出，DPBS清洗3次，每次5 min，用含有0.25% TritonX-100封閉液室溫作用1 h，進行透化、封閉，DPBS清洗3次，每次5 min，加入一抗室溫孵育2 h，DPBS清洗3次，每次5 min，加入對應的熒光二抗室溫孵育1 h，DPBS清洗3次，加入2.5 ng·mL-1DAPI 避光室溫孵育3～5 min，清洗3次，每次5 min，將染色COCs轉移至載玻片，加入5 μL DPBS，蓋玻片封片，其中COCs中CYP19A1蛋白熒光單獨檢測，ATG5、BECLIN1蛋白熒光進行雙染檢測。熒光顯微鏡檢測不同處理組COCs中CYP19A1、ATG5、BECLIN1蛋白熒光。

1.4 AFB1和BPA影響COCs分泌E2的檢測

牦牛COCs成熟培養24 h后，收集不同處理組M199培養液，10倍稀釋后置于-20 ℃冷凍保存，用于E2檢測。參照試劑盒說明采用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測E2濃度，標準品分別為0、7.5、15、30、60、120 pg·mL-1，檢測靈敏度小于1.0 pg·mL-1。

1.5 孤雌激活胚胎發育能力統計

統計不同處理組卵母細胞成熟率后，將成熟裸卵置入含有5 μmol·L-1(Micromolar)去離子霉素的mSOF液，在細胞培養箱避光作用5～10 min，用mSOF液于37 ℃吹打清洗3次，每次不少于5 min，然后將其放入含有2 mmol·L-1二甲基氨基嘌呤mSOF液內，置入細胞培養箱，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養5 h，用預熱DPBS清洗3次，每次5 min，再轉移至G1胚胎培養液，清洗3次，每次1 min，然后轉移到預平衡的G1微滴培養液，每個微滴100 μL含有20枚胚胎，用礦物油覆蓋置入38 ℃、飽和濕度、5.5% CO2條件培養，分別在48 和192 h觀察卵裂胚胎(圖1D)和囊胚數量(圖1E)，以成熟卵母細胞數為基數統計卵裂率，以卵裂胚胎數為基數統計囊胚率。

1.6 數據統計分析

數據分析軟件為SPSS16.0，進行單因素方差試驗數據分析，每個處理設計3個重復。P<0.05 表示差異具有顯著性，所有數據以重復組之間“平均值±標準差(Mean±SD)”表示。

2 結 果

2.1 外源E2、AFB1和BPA調控COCs中CYP19A1表達

收集不同處理組牦牛COCs，qRT-PCR檢測CYP19A1 mRNA相對表達水平,結果如圖2A所示，在AFB1處理組，CYP19A1 mRNA表達水平顯著增加(P<0.05)，為對照組的(10.45±0.39)倍，在10-7mol·L-1E2和BPA處理組CYP19A1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，分別為對照組的(0.56±0.42)倍和(0.32±0.06)倍。

Western blot檢測不同處理組CYP19A1蛋白表達水平結果如圖2B所示，根據灰度值分析不同處理組蛋白相對表達水平如圖2C所示，AFB1處理組CYP19A1蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)，為對照組的(8.23±0.68)倍，10-7mol·L-1E2和BPA處理組CYP19A1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，分別為對照組的(0.42±0.08)和(0.39±0.06)倍。

不同處理組COCs中CYP19A1蛋白免疫熒光檢測結果如圖3所示，對照組COCs中卵丘細胞和卵母細胞均可檢測到CYP19A1蛋白熒光。AFB1處理組CYP19A1蛋白熒光在卵丘細胞和卵母細胞強度高于對照組和其他處理組。10-7mol·L-1E2處理組卵丘細胞和卵母細胞中CYP19A1蛋白熒光強度低于對照組和AFB1處理組，BPA處理組中僅可在擴散卵丘細胞和卵母細胞局部位置檢測到微弱CYP19A1蛋白熒光。

A. CYP19A1 mRNA相對表達水平；B. CYP19A1 蛋白表達檢測；C. CYP19A1蛋白相對表達水平。柱上不同字母表示差異顯著(P < 0.05)，下同A. Relative levels of CYP19A1 mRNA; B. The detection of CYP19A1 protein; C. Relative levels of CYP19A1 protein. Bars with different superscripts are significantly different (P<0.05), the same as below圖2 不同處理組牦牛成熟COCs中CYP19A1表達的檢測Fig.2 Detection for CYP19A1 in yak mature COCs from different groups

2.2 AFB1和BPA對COCs成熟過程中E2合成的影響

為確定AFB1和BPA在上調或下調CYP19A1時對E2合成的影響，采用ELISA技術檢測比較AFB1和BPA處理組與對照組E2的表達水平與變化，結果如圖4所示，與對照組中E2含量(334.27±12.90) pg·mL-1相比，AFB1處理組E2含量顯著增加(P<0.05)，為(426.54±14.26) pg·mL-1，BPA處理組E2水平顯著下降(P<0.05)，為(214.52±10.68) pg·mL-1。

2.3 外源E2和CYP19A1調控影響細胞自噬相關因子表達

qRT-PCR檢測不同處理組細胞自噬相關因子ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ mRNA水平結果如圖5A所示，在10-7mol·L-1E2和AFB1處理組，ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ mRNA表達水平均顯著增加(P<0.05)，其中LC3-Ⅰ在10-7mol·L-1E2處理組表達水平最高，與AFB1處理組差異顯著(P<0.05)。LC3-Ⅱ在AFB1處理組最高，與對照組差異顯著。ATG5、BECLIN1 mRNA水平在10-7mol·L-1E2和AFB1處理組差異均不顯著(P>0.05)，增加幅度也低于LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ幅度。與對照組相比，BPA處理組ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ mRNA表達水平均顯著下降(P<0.05)，而LC3-Ⅱ mRNA表達水平與對照組差異不顯著(P>0.05)。

不同處理組細胞自噬相關因子ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達相對水平如圖5B、5C所示，ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白相對水平均顯著增加(P<0.05)，其中LC3-Ⅱ和ATG5在10-7mol·L-1E2處理組表達水平最高，與AFB1處理組差異顯著(P<0.05)，LC3-Ⅰ和BECLIN1在兩組差異不顯著(P>0.05)。BPA處理組ATG5、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白水平均顯著下降(P<0.05)，而BECLIN1表達水平與對照組差異不顯著(P>0.05)。比較不同處理組LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比率相對量，結果如圖6所示，其在10-7mol·L-1E2和AFB1處理組顯著上升(P<0.05)，其中10-7mol·L-1E2最高，為對照組的(2.02±0.32)倍，AFB1處理組為對照組(1.96±0.15)倍。BPA處理組LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比率相對量顯著降低(P<0.05)，為對照組的(0.82±0.25)倍。

A. 對照組COCs中CYP19A1蛋白檢測; B. AFB1處理組中COCs中CYP19A1蛋白檢測；C. 10-7mol·L-1 E2處理組COCs中CYP19A1蛋白檢測; D. BPA處理組中COCs中CYP19A1蛋白檢測。標尺=100 μmA. Fluorescence of CYP19A1 in COCs from control group; B. Fluorescence of CYP191 in COCs from AFB1 group; C. Fluorescence of CYP19A1 in COCs from 10-7 mol·L-1 E2 group; D. Fluorescence of CYP19A1 in COCs from BPA group. Bar=100 μm圖3 不同處理組牦牛成熟COCs中CYP19A1蛋白免疫熒光標記Fig.3 Staining of CYP19A1 protien in yak mature COCs from different groups

免疫熒光技術檢測不同處理組COCs細胞自噬相關因子ATG5、BECLIN1蛋白如圖7所示，對照組COCs中卵母細胞和周圍卵丘細胞均可觀察到ATG5蛋白熒光，BECLIN1僅在擴散卵丘細胞和局部卵母細胞弱表達。10-7mol·L-1E2和AFB1處理組ATG5和BECLIN1蛋白熒光強度顯著增強，卵母細胞和擴散卵丘細胞均可檢測到ATG5和BECLIN1蛋白，BECLIN1在10-7mol·L-1E2處理組熒光分布更廣，強度高于AFB1處理組。BPA處理組僅可檢測到微弱ATG5和BECLIN1蛋白熒光，且卵丘細胞未發生充分擴散。

圖4 不同處理組E2的表達水平Fig.4 Levels of E2 in different groups

2.4 外源E2和CYP19A1調控影響牦牛卵母細胞發育能力

統計不同處理組牦牛卵母細胞成熟率、孤雌激活胚胎卵裂率和囊胚率，結果如表2所示，10-7mol·L-1E2和AFB1處理組卵母細胞成熟率和胚胎卵裂率顯著高于對照組(P<0.05)，其中10-7mol·L-1E2和AFB1處理組卵母細胞成熟率差異顯著(P<0.05)，以成熟卵母細胞為基數，10-7mol·L-1E2和AFB1處理組胚胎卵裂率差異不顯著(P>0.05)。BPA處理組中，卵母細胞成熟率、卵裂率與對照組相比，顯著降低(P<0.05)。以卵裂胚胎為基數統計囊胚率，結果顯示4個處理組囊胚率差異不顯著(P>0.05)。

A. ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ mRNA相對表達水平；B. ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達檢測；C. ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白相對表達水平A. Relative levels of ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ mRNA; B. The detection of ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ protein; C. Relative levels of ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ protein圖5 不同處理組牦牛成熟COCs中ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ 表達的檢測Fig.5 Detection for ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ in yak mature COCs from different groups

圖6 不同處理組LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比率的變化Fig.6 Changes of ratio of LC3-Ⅱ to LC3-Ⅰ in different groups

3 討 論

細胞色素家族成員參與動物下丘腦-垂體-性腺軸調控[21-22]，CYP19A1作為細胞色素家族核心成員，牛顆粒細胞中miR-326和CYP19A1的表達水平呈負相關，調控miR-326可通過環腺苷酸反應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)下調CYP19A1轉錄，導致靶細胞E2分泌減少[13-14]。除CYP19A1對激素調控外，卵巢中激素水平在一定程度也可以影響CYP19A1表達，如FSH可激活CYP19A1基因啟動子而改變其表達水平，誘導E2合成，進而影響卵丘細胞質量[16]。本研究參照前人研究成果，在牦牛COCs成熟過程中加入AFB1或BPA[18-19]均可調控CYP19A1表達，證實AFB1或BPA在生殖細胞作用效果與人絨毛膜癌細胞作用效果具有相似性，并影響生殖細胞E2合成，造成卵母細胞成熟率和早期胚胎發育能力發生改變。牦牛COCs成熟過程中加入10-7mol·L-1外源E2，CYP19A1表達水平下降，證實高濃度外源E2負反饋調節CYP19A1表達，表明動物卵母細胞成熟過程中CYP19A1與E2之間存在相互調控關系。

A. 對照組COCs中ATG5、BECLIN1蛋白檢測; B. 10-7mol·L-1 E2處理組COCs中ATG5、BECLIN1蛋白檢測; C. AFB1處理組中COCs中ATG5、BECLIN1蛋白檢測；D. BPA處理組中COCs中ATG5、BECLIN1蛋白檢測。標尺=100 μmA. Fluorescence of ATG5、BECLIN1 in COCs from control group; B. Fluorescence of ATG5、BECLIN1 in COCs from 10-7mol·L-1 E2 group; C. Fluorescence of ATG5、BECLIN1 in COCs from AFB1 group; D. Fluorescence of ATG5、BECLIN1 in COCs from BPA group. Bar=100 μm圖7 不同處理組牦牛成熟COCs中ATG5和BECLIN1蛋白免疫熒光標記Fig.7 Immunofluorescence staining of ATG5 and BECLIN1 protein in yak mature COCs from different groups

表2 不同處理組卵母細胞成熟率與胚胎發育能力統計

為模擬牦牛COCs體內生長條件，研究中并未采用基因干擾技術精確調控卵丘細胞CYP19A1表達，而利用安全生理濃度AFB1或BPA改變牦牛COCs中CYP19A1表達，在有效避免AFB1或BPA細胞毒性效應的基礎上，探索其對卵母細胞成熟的影響。相關研究證實在體細胞中，BPA除調控CYP19A1外，還可調控CYP1A1表達[19]，表明AFB1和BPA對細胞色素酶家族成員的調控具有多樣性和復雜性，提示后續建立卵丘-卵母細胞共培養體系實現CYP19A1基因精確調控技術，對于探索CYP19A1調控COCs發育分子機制至關重要。除CYP19A1外，CYP2C8、CYP17A1、CYP11A1也參與動物生理調控，且多數參與細胞自噬調控[23-25]，而其是否參與牦牛生殖調控仍需結合牦牛自身生殖特性進一步探索。

E2作為內源性激素可調控多種動物卵母細胞成熟和卵泡發育等生物學事件，如E2刺激豬卵母細胞成熟過程中Ca2+離子釋放[26]，維持動物COCs活力，促進卵子發育[27-28]。團隊前期研究發現，10-7mol·L-1E2調控牦牛卵母細胞成熟過程中卵丘擴散相關因子前列腺素內過氧化物合酶2 (prostaglandin endoperoxide synthase 2, PTGS2)、透明質酸合成酶2(hyaluronan synthase 2, HAS2)、腫瘤壞死因子α誘導蛋白6(tumour necrosis factor alpha-induced protein 6, TNFAIP6)表達，利于卵丘細胞擴散[29]。本研究用外源性E2作用牦牛COCs，在證實其可調控卵母細胞自噬水平，并影響其早期發育能力的基礎上，發現CYP19A1調控的內源性E2也具有相似生物學功能，如BPA抑制CYP19A1表達下調內源性E2合成(圖4)，進而影響卵丘細胞擴散程度(圖7)，進一步表明E2促進動物卵丘細胞擴散的生理功能。豬卵母細胞體外成熟過程中高濃度外源E2降低卵母細胞成熟率，但可抑制細胞凋亡水平[26]，表明E2生理功能具有物種差異性。除此之外，卵母細胞成熟過程中E2分子機制存在復雜性，如本研究證實外源性和內源性E2均可調控牦牛卵母細胞自噬，該發現與相關研究證實E2可激活其受體ESR調控細胞自噬具有相似性[26]。E2調控自噬的效果受低氧、溫度應激等因素影響，如溫度應激時，熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)作為分子伴侶導致ESRs構象改變，影響自噬相關基因表達[26]，提高卵母細胞對熱休克等生理應激的適應性[26]，使家畜性腺細胞中其他激素合成發生改變[30-31]。

雖然不同物種間生殖激素調節自噬機制不同，但啟動細胞自噬調節因子存在相似性[32-33]。本研究通過改變CYP19A1水平，影響了E2合成，或加入外源性E2，發現采用兩種不同方法調控E2水平均可改變自噬相關因子ATG5、BECLIN1、LC3表達(圖5)。ATG5、BECLIN1、LC3表達水平在促進內源E2表達和加入外源E2的兩個處理組之間存在差異，抑制內源E2，ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ 降低幅度也存在差異，表明內源E2和外源E2調控細胞自噬的分子機制及其主要作用靶標基因存在一定差異。細胞或機體內LC3-II/LC3-I比率差異提示LC3核心因子轉化發生改變，且LC3-II水平與自噬小體的數量相關[34-36]。本研究中加入外源E2和促進內源E2表達均可提高LC3-II/LC3-I比率相對水平，抑制內源E2降低兩者比率相對水平，提示LC3在E2調控哺乳動物卵母細胞自噬中的生物學作用不能忽視。

為探索COCs成熟過程中調控CYP19A1對牦牛卵母細胞發育能力影響，研究分別以未成熟卵母細胞數量、成熟卵母細胞數量和卵裂胚胎為基數比較各處理組成熟率、卵裂率和囊胚率差異，發現CYP19A1主要影響早期卵母細胞成熟和胚胎卵裂，在卵裂胚胎發育至囊胚階段影響并不顯著，而胚胎早期發育卵裂之前主要生物事件為胚源基因激活[37-38]，可見CYP19A調控雌激素合成主要影響卵母細胞的早期發育能力。豬早期胚胎發育研究表明，氧化應激誘導卵母細胞自噬可改變囊胚細胞凋亡水平，并通過細胞命運改變囊胚細胞數、ICM和TE分布，影響囊胚質量[39]。因此，后續仍需通過檢測囊胚相關分子變化，從囊胚質量、胚胎附植潛能、細胞分化等角度深入探索CYP19A1促進E2調控細胞自噬，影響卵母細胞后續發育能力的分子機制。

牦牛長期生活在高原環境，為季節性發情家畜，其生殖能力相對同種屬其他家畜處于較低水平[40-41]。改善牦牛繁殖調控技術已成為牦牛高效繁育的核心問題，而提高生殖激素的作用效果對牦牛繁殖調控技術的提升至關重要。本研究發現利用小分子藥物調控CYP19A1水平影響牦牛COCs激素合成，進一步影響卵母細胞成熟和胚源基因激活前的發育潛能，揭示牦牛繁殖調控過程中CYP19A1可作為標靶分子改善生殖激素作用效果，提示篩選相關藥物或靶標信號分子調控CYP19A1表達水平，有助于協同生殖激素調控牦牛繁殖狀態，促進牦牛輔助繁殖技術發展。

4 結 論

牦牛COCs成熟過程中CYP19A1上調內源性E2水平，其上調的E2與外源性E2生理功能具有相似性，均可誘導細胞自噬發生，提升早期卵母細胞的發育能力。研究結果為深入探索生殖激素調控哺乳動物卵母細胞成熟的分子機制提供了理論依據。