紅景天苷通過HIF-1α/NF-κB信號通路對阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征大鼠炎癥的調(diào)控作用

吳格怡 黃心蔚 鄭美喬 劉嘉慧

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）是一種以夜間反復(fù)間歇低氧為特征的疾病，其引起的多臟器損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的炎癥介質(zhì)增加相關(guān)[1]，研究表明，引起這一系列反應(yīng)的途徑為低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）/核因子-κB（NF-κB）信號通路[2]。OSAHS的慢性間歇低氧使HIF-1α/NF-κB信號通路激活，其下游炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）增加，造成機(jī)體各種損傷[3]。紅景天具有抗衰老、抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)免疫、清除氧自由基等作用。本研究旨在觀察紅景天苷通過HIF-1α/NF-κB信號通路對OSAHS大鼠炎癥的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試劑材料紅景天苷（貨號：BP1020-20mg）購自廣州剪刀手基因科技有限公司，TNF-α（貨號：JM-01587-R2）、IL-6（貨號：JL18212-96T）、IL-8（貨號：JM-04713H1-96T）、ELISA檢測試劑盒均購自深圳市文樂生物科技有限公司，HIF-1α抗體（貨號：YCKJ-RJ-038165）購自北京標(biāo)譜檢測科技有限公司，NF-κB抗體（貨號：YCKJ-RJ-022161）購自廣州譽(yù)嘉生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及造模購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心的標(biāo)準(zhǔn)雄性大鼠[許可證號 SCXK（粵）2013-0002]共56只，周齡（10±2）周，體重（230±20）g。按隨機(jī)原則分為正常對照組、慢性間歇低氧組、紅景天苷低劑量組、紅景天苷高劑量組各9只，適應(yīng)性喂養(yǎng)后開始造模。除正常對照組外，其余27只大鼠均放養(yǎng)于間歇低氧倉內(nèi)，參照文獻(xiàn)[4]中間歇低氧倉建造方法。增加倉內(nèi)氮?dú)鈺r(shí)，倉內(nèi)氧濃度下降，增加倉內(nèi)氧氣時(shí)，倉內(nèi)氧濃度上升，間歇循環(huán)時(shí)間為8min。造模時(shí)間共8周，每天8h（9：00-17：00）。在造模的最后1周，每次入倉前，紅景天苷低劑量組給予紅景天苷20mg/kg，紅景天苷高劑量組給予紅景天苷100mg/kg腹腔注射，正常對照組、慢性間歇低氧組注射等量生理鹽水，時(shí)間共7d。

1.3 取材及檢測

1.3.1 取材 8周后36只大鼠均予腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心臟采血，血液靜置離心后，取上清液于-80℃冷藏以備ELISA檢測。大鼠處死后剪取適量肺組織，于液氮中迅速冷卻，-80℃凍存以備Western blot檢測。

1.3.2 ELISA檢測 取冷藏上清液，樣品孔中加入待測上清液，封膜，4℃過夜后洗板。室溫下加入一抗，封膜后孵育1h，再洗板3次；室溫下加入二抗，封膜后孵育1h，再洗板3次。顯色后終止反應(yīng)，450nm波長吸光度檢測TNF-α、IL-6、IL-8含量。

1.3.3 Western blot檢測 取凍存肺組織，清潔后液氮下磨成粉末狀，加入含PMSF的裂解液冰上裂解30min。成品移入離心管，4℃下15 000r/min離心20min，吸取上清細(xì)胞裂解液，BCA法檢測蛋白濃度。沸水加熱5min使蛋白變性，依次配膠，上樣后電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，TBST洗膜5min，用麗春紅染膜，檢測轉(zhuǎn)膜效率。5%脫脂奶粉室溫封閉1h，洗膜3次。TBST按比例稀釋（HIF-1α 1:1000，NF-κB 1:1000，β-actin 1:2000）后加入一抗，搖床上4℃孵育過夜，復(fù)溫后TBST洗膜3次；加入1：1000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG二抗，搖床上4℃孵育過夜，復(fù)溫后TBST洗膜3次。ECL發(fā)光液顯影，定影液顯色，底片曝光，掃描，分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比較與正常對照組比較，其余3組TNF-α、IL-6、IL-8水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與慢性間歇低氧組比較，紅景天苷低劑量組和紅景天苷高劑量組TNF-α、IL-6、IL-8水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與紅景天苷低劑量組比較，紅景天苷高劑量組TNF-α、IL-6、IL-8水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比較（±s，n=9）

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平比較（±s，n=9）

注：與正常對照組相比，△P＜0.05；與慢性間歇低氧組相比，＃P＜0.05；與紅景天苷低劑量組相比，*P＜0.05

2.2 各組大鼠肺組織HIF-1α和NF-κB蛋白表達(dá)比較與正常對照組相比，慢性間歇低氧組大鼠HIF-1α和NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05），而應(yīng)用紅景天苷腹腔注射后，紅景天苷低劑量組和紅景天苷高劑量組大鼠HIF-1α和NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），紅景天苷高劑量組下調(diào)更明顯（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠HIF-1α和NF-κB蛋白表達(dá)比較

表2 各組大鼠HIF-1α和NF-κB蛋白表達(dá)量比較（±s）

表2 各組大鼠HIF-1α和NF-κB蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與正常對照組相比，△P＜0.05；與慢性間歇低氧組相比，＃P＜0.05；與紅景天苷低劑量組相比，*P＜0.05

3 討論

OSAHS是一種睡眠呼吸障礙性疾病，占睡眠呼吸疾病的70%以上[5]，其因鼻咽等上呼吸道因素導(dǎo)致慢性間歇低氧而引起一系列問題。由于慢性間歇低氧，體內(nèi)TNF-α、IL-6等炎癥因子增加，而這些因子的增加也可加重上呼吸道阻塞，導(dǎo)致惡性循環(huán)[6]。

慢性間歇低氧大鼠體內(nèi)的多種炎癥因子包括TNF-α、IL-6、IL-8等均由NF-κB調(diào)控、轉(zhuǎn)錄。在生理狀況下，NF-κB并不表達(dá)或表達(dá)很少，與其抑制因子（Inhibitor of NF-κB，IκB）結(jié)合，為無活性狀態(tài)存在于胞漿中。疾病中的物理及化學(xué)因素刺激均可導(dǎo)致這種結(jié)合的分離，如病毒、細(xì)菌內(nèi)毒素、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及OSAHS的特征性改變-慢性間歇低氧。在這些變化刺激中，NF-κB與靶基因、增強(qiáng)子或早期炎癥反應(yīng)基因再結(jié)合，TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子大量產(chǎn)生。TNF-α是促炎因子，并且是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要因子，其過度應(yīng)答聚集了大量中性粒細(xì)胞，繼而上調(diào)IL-8的表達(dá)，IL-8可進(jìn)一步趨化中性粒細(xì)胞，炎癥反應(yīng)更加嚴(yán)重[7]。

在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，HIF-1α/NF-κB信號通路具有重要作用。HIF-1α是HIF-1的一個(gè)亞基，受缺氧信號刺激激活NF-κB信號通路經(jīng)典途徑[8，9]。NF-κB是一種能與許多基因啟動子κB序列結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能的核因子[10]。有學(xué)者認(rèn)為，OSAHS患者更多是先活化NF-κB而導(dǎo)致整個(gè)炎癥途徑的激活[11]：患者機(jī)體反復(fù)發(fā)作性缺氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，體內(nèi)的活性氧（ROS）可通過有絲分裂原激活NF-κB的磷酸化途徑，使IκB蛋白降解，NF-κB解離，NF-κB活化并進(jìn)入細(xì)胞核，與相應(yīng)DNA序列結(jié)合，激活一系列如TNF-α、IL-6、IL-8下游炎癥因子，加重炎癥。HIF-1α同樣可以刺激炎癥因子增加，OSAHS患者脯氨酰羥化酶受到抑制，HIF-1α不能完全泛素化及羥基化[12]，因此HIF-1α水平增加。而在缺氧狀態(tài)下，細(xì)胞也可以通過PI3K/AKT/mTOR和Ras/MAPK等通路使HIF-1α表達(dá)增加[13，14]。同時(shí)，HIF-1α與NF-κB相互影響導(dǎo)致OSASH炎癥的發(fā)生發(fā)展，內(nèi)皮素-1（ET-1）可通過 HIF-1α激活 NF-κB途徑參與 OSAHS相關(guān)血管重構(gòu)[15]；而NF-κB也可以反過來激活病灶部位的HIF-1α，HIF-1α通過誘導(dǎo)糖酵解酶導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞（EC）過度增殖，促進(jìn)這些部位的動脈粥樣硬化和炎癥[16]。

紅景天苷是從中藥紅景天中提取的主要成分，具有抗衰老、抗缺氧、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)心肺組織等多種作用[17]。本研究顯示，經(jīng)紅景天苷腹腔注射的大鼠NF-κB、HIF-1α蛋白表達(dá)均下降，且與紅景天苷的劑量有關(guān)。紅景天苷可作用于OSAHS患者的NF-κB及P38信號通路，達(dá)到抗炎效果[18]，亦可使脯氨酰羥化酶活化而減少HIF-1α的產(chǎn)生[19]。完整的NF-κB信號通路有賴于HIF-1α的表達(dá)及調(diào)節(jié)水平[20]。根據(jù)本研究結(jié)果推測，紅景天苷抑制HIF-1α的產(chǎn)生，并進(jìn)一步抑制NF-κB的表達(dá)，從而下調(diào)TNF-α、IL-6、IL-8炎癥因子的表達(dá)。

綜上所述，HIF-1α及NF-κB在炎癥過程中相互影響，紅景天苷抑制其表達(dá)從而減少其下游炎癥因子產(chǎn)生，達(dá)到保護(hù)OSAHS患者機(jī)體作用。而此過程中，HIF-1α/NF-κB信號通路作用機(jī)制及更多的靶因子仍有待進(jìn)一步深入研究。