哮喘患兒NR3C1及GLCCI1基因多態性的臨床預測價值*

楊艷，盧慧娜，陳霞△，馮靜，賀穎，張瓊瓊，王艦輝

（1.中國人民解放軍陸軍第九五八醫院兒科，重慶 400020；2.重慶市中醫院兒科，重慶 400021）

當前，兒童哮喘的發病率逐年上升，雖然許多藥物［如吸入性糖皮質激素（ICS）］臨床被批準用于治療哮喘，但仍缺乏針對性。哮喘患者對ICS的反應存在個體差異，因為ICS應答約70%的變異由目標基因的遺傳特征決定。近年來全基因組關聯研究中發現的基因（如GLCCI1、FBXL7、T、ALLC、CMTR1）可能在哮喘診斷/治療反應通路中發揮直接或間接作用。有研究提示，皮質激素誘導轉錄物1（GLCCI1）通過IL-13/periostin/TGF-β1信號通路調節哮喘氣道重塑［1］，糖皮質激素受體基因（NR3C1）的遺傳變異與哮喘患者對ICS的反應密切相關［2］。為此，本研究中以重慶市兩家醫院兒科收治的哮喘患兒為研究對象，分析了NR3C1及GLCCI1基因多態性與ICS對患兒療效的相關性，為臨床醫師制訂個體化治療方案提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準：符合2016年中華醫學會兒科學分會呼吸學組《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中診斷標準；臨床資料完整。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患兒家屬簽署知情同意書。

排除標準：近1周內有呼吸道感染病史；自身免疫疾病、遺傳代謝性疾病；合并慢性腎功能衰竭等慢性疾病；精神發育遲滯，無法配合本研究。

病例選擇與分組：選取陸軍第九五八醫院和重慶市中醫院兒科2020年12月至2022年1月收治的哮喘患兒40例，作為觀察組；另選擇此兩家醫院同期未診斷哮喘患兒43例，作為對照組。

1.2 方法

觀察組患兒單次霧化吸入布地奈德混懸液（四川普銳特藥業有限公司，國藥準字H20213286，規格為每支2 mL∶1 mg）0.5～1 mg 4 h后，檢測第1秒用力呼氣容積（FEV1）；然后予丙酸氟替卡松吸入氣霧劑（Glaxo Wellcome S.A.，進口藥品注冊證號H20130189，規格為每撳50μg或125μg）經口吸入，每次1撳，每日2次，持續治療3個月后，檢測肺功能。對照組在相同時間點檢測FEV1。

1.3 多重聚合酶鏈式反應（PCR）高通量測序（NGS）驗證檢測

于治療前抽取患兒外周靜脈血2 mL，抗凝、離心、分離后提取基因組DNA，置-80℃凍存。GLCCI1基因rs37973位點上游引物：5-'TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACCACGAGCAGACCAATTTGA-3'，下游引物：5'-AGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAATTTACCCCACAGTAAAG-3'；NR3C1基因rs42423247位點上游引物：5-'TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTTGCAGGAACATTTGAACG-3'，下游引物：5'-AGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGTGAACAGTGTACCAGAC-3'。

PCR反應體系為20μL，內含Ready Reaction Premix 1μL，BigDye sequencing Buffer 3.5μL，引物終濃度為0.1μmol/L，PCR產物20 ng，超純水定容至20μL。反應條件為：96℃變性1 min，96℃10 s、50℃5 s、60℃4 min，循環25次。PCR產物經純化后，用基因測序儀測序。

1.4 觀察指標

觀察患兒的臨床指標；基因型、等位基因的分布；不同基因型患兒治療前后肺功能的改變情況。

1.5 統計學處理

采用SPSS 14.0統計學軟件分析。計量資料以±s表示，行t檢驗；計數資料以率（%）表示，行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

兩組患兒臨床指標見表1；不同位點基因型分布無顯著差異（P＞0.05），見表2；吸入ICS 3個月后各基因型的肺功能比較見表3（MMEF75/25為最大呼氣中期流量，FVC為用力肺活量，FEF75為75%FVC水平的呼氣流量）。觀察組吸入ICS 4 h后FEV1明顯改善（改善率＞15%）患兒基因型分布見表4。

表1 兩組患兒臨床指標比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics between the two groups

表2 兩組患兒不同位點基因型分布Tab.2 Distribution of different loci genotypes in the two groups

表3 觀察組各基因型患兒肺功能比較（±s）Tab.3 Comparison of pulmonary function of children with different genotypes in the observation group（±s）

表3 觀察組各基因型患兒肺功能比較（±s）Tab.3 Comparison of pulmonary function of children with different genotypes in the observation group（±s）

注：與同位點同基因型治療前比較，*P＜0.01；與同位點C/C基因型比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the same locus genotype before treatment，*P＜0.01；Compared with C/C genotype at the same locus，#P＜0.05，##P＜0.01.

位點rs41423247 rs37973基因型G/G G/C+C/G C/C G/G G/A+A/G A/A FEV1/預計值%治療前68.77±4.53 66.98±5.09 76.33±3.65 64.42±3.94 68.91±4.53 70.76±9.97治療3個月后93.11±3.25*93.11±3.15*80.94±3.46 91.47±2.47*93.44±3.90*93.44±6.30*MMEF75/25/預計值%治療前74.38±3.40 74.12±4.22 75.84±1.77 72.26±3.95 74.78±3.90 73.77±2.32治療3個月后96.72±3.90*95.74±3.65*78.21±1.67 94.06±3.49*96.66±5.00*94.14±7.99*FEV1/FVC變化（%）15.11±4.96##16.74±5.46#1.51±1.20 17.92±16.92 15.19±4.78 11.17±5.66 FEF75變化（%）19.18±6.39##16.98±6.15#1.84±1.34 11.98±5.26 19.66±5.78 17.29±9.11

表4 觀察組吸入ICS 4 h后FEV1明顯改善患兒的基因型分布Tab.4 Distribution of genotypes in children with significantly improved FEV1 at 4 h after ICS inhalation in the observation group

3 討論

ICS是控制和管理哮喘的一線藥物，可提高哮喘患兒的FEV1，增加無癥狀天數，降低住院率及加重次數。但臨床發現哮喘患者對ICS反應具有高度個體可重復性和個體差異性，且患者對ICS抵抗或不敏感是影響哮喘療效的關鍵因素。哮喘患兒對ICS治療反應的差異性不僅與氣道炎癥的類型有關，更基于藥物基因組學的個體化差異，然而對哮喘藥物遺傳變異的分析仍存在較多難題。多種因素（如環境作用）和復雜的遺傳背景（包括易感表型異質性）等使哮喘藥物基因學研究復雜化。不同地區、不同種族等的單核苷酸多態性位點（SNP）各基因型對藥物的敏感性均不同，這導致研究報道結果不一致，藥物基因組學研究也將成為個體化精準用藥的重要參考依據［3］。本研究中立足于重慶市兩家醫院收治的哮喘患兒，探討與ICS作用機制密切相關的GLCCI1和NR3C1基因多態性對哮喘易感性及ICS療效的預測作用。

國內外學者對多個影響哮喘患兒ICS反應SNPs的研究，已證實GLCCI1是主要候選基因。GLCCI1編碼一種功能未知的蛋白，可表達糖皮質激素誘導蛋白水平并可能成為激素導致細胞凋亡的早期標記物。目前認為，GLCCI1基因位于第7號染色體短臂2區1帶，內有8個外顯子。既往對于rs37973位點的研究，初步確定G等位基因與治療反應較差有關［4-5］。rs37973位點編碼一種功能未知的蛋白質，導致哮喘患者對ICS治療的反應降低。該SNP與rs37973 SNP在同一基因上存在完全連鎖不平衡，從而影響GLCCI1基因的表達［1］。然而，另一項研究并未證實GLCCI1基因rs37973位點能預測對ICS治療的反應［6］。TANTISIRA等［7］的研究表明，非西班牙裔白種rs37973純合子GG基因型哮喘患者應用糖皮質激素治療后FEV1的改善率僅為野生型的1/3［7］，而RIJAVEC等［8］對208例成年哮喘患者研究發現，經過3個月ICS治療后，GG基因型患者FEV1占預計值百分比明顯高于AA+AG基因型患者，且這種基因依賴型的不同主要存在于非吸煙和過敏患者。因此認為，吸煙及過敏影響藥物基因檢測結果，而GG基因型患者可獲得更好的ICS療效。另外發現，GLCCI1基因變異可加速ICS治療后肺功能改善，同樣情況也發現在漢族人群［9-10］。HOSKING等［5］證實，GLCCI1基因rs37973位點不能作為白種哮喘患者ICS療效預測的指標。郝珉等［11］研究發現，GLCCI1基因另一個SNP rs37972位點TT型患兒經12周的ICS治療，FEV1和FEV1/FCV較治療前無明顯改善，說明該位點該基因型對ICS的療效差。本研究中發現，兩組GLCCI1基因rs37973位點3種基因型（GG，GA，AA）患兒發病率無明顯差異。觀察組經ICS治療4 h后G/G基因型療 效 較G/A+A/G及A/A基因型差，而3個月后該組3種基因型比較無明顯差異。提示GLCCI1基因rs37973位點可能與兒童哮喘無明顯相關性，且ICS長期治療反應與該位點基因型（GG，GA，AA）相關性不明顯。

糖皮質激素受體（GR）編碼的基因NR3C1，位于5q31-32，包含8個內含子和9個外顯子，編碼800個氨基酸。GR是調節下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）的關鍵作用點，而HPA軸亢進與NR3C1表達下調有關。NR3C1位于染色體，包含一簇細胞因子和其他免疫相關基因，包括白細胞介素（IL）-4、IL-5、IL-9、IL-13、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、CD14、白三烯C4合酶（LTC4S）等。有研究表明，rs41423247為哮喘等炎性疾病的易感位點。KESKIN等［12］證實，攜帶rs41423247純合子G等位基因中重度哮喘患兒吸入高劑量ICS后FEV1可顯著改善。另有研究表明，rs41423247位點C等位基因與保護HPA有關，CC基因型與促腎上腺皮質激素最高反應相關［2，13］。本研究中發現，rs41423247位點與哮喘易感性無明顯相關，但觀察組rs41423247 SNP G/C+C/G基因型患兒吸入ICS 4 h后FEV1改善≥15%比例較G/G及C/C基因型患兒明顯降低。吸入ICS 3個月后rs41423247位點G/G及G/C+C/G基因型FEV1占預計值百分比、MMEF75/25占預計值百分比較治療前明顯改善，而等位基因C/C患兒吸入ICS 3個月后肺功能改善不顯著。rs41423247 SNP G/G及G/C+C/G基因型患兒FEV1/FVC變化率、FEF75變化率與C/C基因型比較有顯著差異（P＜0.05）。提示rs41423247 SNP G/C+C/G基因型吸入ICS短期療效較差，而C/C基因型對ICS長期治療不敏感。本研究中還測定了對照組各基因型吸入ICS 4 h后肺功能變化情況，因FEV1改善≥15%病例數較少而未進一步統計。

綜上所述，GLCCI1基因rs37973位點并非兒童哮喘易感因素，SNP G/G基因型患兒吸入ICS 4 h后FEV1改善≥15%比例較G/A+A/G、A/A基因型明顯下降，而長期ICS治療反應與基因型無明顯相關性。NR3C1基因rs41423247位點與哮喘易感性無明顯相關性，但G/C+C/G基因型患兒吸入ICS 4 h后FEV1改善≥15%比例較G/G及C/C基因型明顯降低，而C/C基因型吸入ICS 3個月后FEV1/FVC變化率、FEF75變化率較G/G及G/C+C/G基因型顯著降低。但本研究樣本量較小，以后研究中將擴大樣本量，且ICS的長短期療效差異是否與基因型或環境因素（如抽煙、大氣污染等）相關，也需進一步論證。